【毕业学位论文】（Word原稿）亲和病原菌诱导黄瓜抗病性机制初步研究植物病理学硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 亲和病原菌诱导黄瓜抗病性机制初步研究 I 摘 要 诱导抗病以其自身的广谱性、持效性及环保性等特点为植物病害综合防治技术的研发开辟了新的途径，近几年来得到了学术界的高度重视。而亲和病原菌诱导植物系统抗病性的现象虽然在田间普遍存在，但一直没有引起广泛地关注。本文从植物诱导抗病性出发，以黄瓜亲和病原菌为激发子，较为系统地研究了黄瓜“交互保护”作用、系统诱导抗病现象及其相关机理。 和病原菌能够诱导黄瓜“交互保护”作用的产生。黄瓜经一种病原菌诱导接种后可以产生对多种病害的抑制作用。预先接种黑星病菌 （ 、白粉病菌 （ 及细菌性角斑病菌 （ 1的黄瓜植株可产生对霜霉病的“交互保护”作用，相对防效可分别达到 这种保护作用同样存在于同种病原菌之间，预先接种细菌性角斑病菌的植株可产生对该病的抗 性，防效可达 而且“交互保护”作用的强弱与诱导时间有关，其中以间隔 48h 的效果最好，持效期可达 20 天以上。 细菌性角斑病菌预先接种黄瓜的第一片真叶，可使第一到第四片真叶均表现出抗病性，对角斑菌的防效可分别达到 同样，预先接种黄瓜子叶也得到了相似的结果，且这种抗病作用可以持续 3 周以上。 细菌性角斑病菌诱导黄瓜后，叶片中具有杀菌活性的物 质 植保素的含量显著提高；同时，细胞壁的组成成份木质素和富含羟脯氨酸糖蛋白的含量也明显提高，且均于诱导后 48h 达到最高峰。这说明亲和病原菌的诱导能提高植株的化学防病及物理防御能力，使植株得到保护。 抗病性相关的物质脂氧合酶（ 一氧化氮（ 活性氧（ 内源信号物质水杨酸（ 活性或含量均有增加。诱导叶片及未经诱导的上位、下位叶片中 含量明显增加，并于诱导后 72h 达到峰值；而 活性或含量的最大值出现在 48h。同样， 含量也于诱导后 48h 达到高峰。这说明，亲和病原菌诱导一片叶片，可以使整株植物同时发生防卫反应，表达出系统抗病性。 综上所述，亲和病原菌可以诱导黄瓜产生系统抗病性，增强植株的抗病能力，达到兼控多种病害的目的。该现象的发现为生物因子诱导植物产生抗病性提供了例证，也为病害综合防治新技术的提出奠定了一定的理论依据。 关键词： 黄瓜，亲和病原菌，“交互保护”作用，系统诱导抗病性 of is a to in to by a a of In as to of in 1. in of 1in to . 1 is 48 is 0 2. in of . 1to by . 1at 3. of in . 1of an of of It in 4. . 1or as 2O2 in or up to 2h or NO A 8h. in In by to by 录 第一章 绪论 . 1 物诱导抗病性的相关概念 . 1 物系统诱导抗病性的诱导激活剂及其特征 . 2 生物诱导剂 . 2 物诱导剂 . 3 物系统诱导抗病性的可能机制 . 5 织病理学机制 . 5 理生化机制 . 6 子生物学机理 . 6 题与展望 . 7 第二章 亲和病原菌诱导黄瓜产生的“交互保护”作用 . 8 料与方法 . 8 验材料 . 8 验方法 . 8 果与分析 . 9 和病原菌激发子诱导抗病性条件的研 究 . 9 和病原菌诱导黄瓜产生 “交互保护 ”作用的研究 . 10 种对 “交互保护 ”作用的影响 . 15 论与讨论 . 16 第三章 亲和病原菌诱导黄瓜产生的系统抗病性（ . 17 料与方法 . 17 试材料 . 17 验方法 . 17 果与分析 . 18 斑病菌诱导子叶后黄瓜的系统抗病性 . 18 斑病菌诱导真叶后黄瓜系统抗病性的表达 . 19 论与讨论 . 20 第四章 亲和病原菌诱导黄瓜“交互保护”作用机制的 初步研究 . 21 料与方法 . 21 试材料 . 21 验方法 . 21 果与分析 . 23 和病原菌诱导黄瓜后叶片中植保素的产生 . 23 和病原菌诱导黄瓜后叶片中木质素的变化 . 27 脯氨酸糖蛋白（ 量的测定 . 29 论与讨论 . 29 和病原菌诱导黄瓜植保素的合成 . 29 和病原菌诱导黄瓜木质素的积累 . 30 和病原菌诱导黄瓜 产生 . 30 第五章 亲和病原菌诱导黄瓜系统抗病性机制的初步研 究 . 31 料与方法 . 31 试材料 . 31 验方法 . 31 和病原菌诱导黄瓜系统抗病性机理的研究 . 32 氧合酶活性的变化 . 32 氧化氮（ 量的变化 . 34 性氧（ 量的变化 . 35 杨酸（ 量的变化 . 35 论与讨论 . 36 第六章 结 论 . 38 和病原菌诱导黄瓜产生 “交互保护 ”作用的研究 . 38 和病原菌诱导黄瓜系统抗病性（ 研究 . 39 和病原菌诱导黄瓜产生 “交互保护 ”作用的机理 . 39 和病原菌诱导黄瓜产生系统抗病性机理的初步研究 . 40 参考文献 . 42 致谢 . 47 作者简历 . 48 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 统诱导抗病性 氧合酶 NO 氧化氮 SA 杨酸 脯氨酸糖蛋白 层层析 效液相色谱分析 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 植物病害的发生始终是制约农业发展的主要因素之一。目前 ，防治植物病害的主要方法仍然是使用化学农药，但高频率的施用农药对人类及环境带来了巨大的隐患。近代病理学研究表明：植物本身存在着潜在的抗病基因，通过适当的诱导激活该基因的表达就可以使植物获得对病原菌的抗性。而且这种由外界因子诱导所产生的抗病性具有环保性、广谱性和持久性，不仅可以解决化学防治引起的病原菌抗药性、环境污染等负面影响，还将为食品无害化生产提供新的手段。 目前，系统诱导抗病性已经得到学术界的关注，但真正的研究工作距今只有半个多世纪，本章对系统诱导抗病性的相关概念及国内外研究进展进行了简要的介绍。 物诱导抗病性的相关概念 植物诱导抗病性的现象很早就被发现，然而关于植物诱导抗病性的研究工作却始于上世纪 50年代。最初人们把这种现象叫做获得抗性（ 获得性免疫（ 近几年才开始正式使用诱导抗病性（ 个词。 利用物理的、化学的以及生物的方法处理植物以改变其对病害的反应 ， 使原来感病的植物产生局部的或系统的抗性 ， 称诱导抗病性。 它分为局部诱导抗病性和系统诱导抗病性。局部抗性（ 只在诱导部位周围产生的抗性，其典型例子是过敏性坏死反应，是通过侵染点周围细胞的坏死而阻止病菌扩展的现象，常常伴随植保素的大量增加。系统抗性（ 指诱导后植物整株都表现出抗病性。 植物系统诱导抗病性（ 植物抵抗病原菌侵染的一种主要特性，指植物经某些化学物质、病原菌或其弱毒株系诱导或接种后，被接种的植物产生新的、广谱的系统抗性，从而对病原菌再次侵染以及其他病菌的侵染均具有很强的抑制性。该抗性可扩展 到整个植株 （李冠等， 1990）。 诱导抗病性与交叉保护（ 干扰（ 同，交互保护是指由于亲缘关系相近的病原菌间的相互作用从而使植物免于受害，特别是病毒病害。干扰是指两种或多种无亲缘关系的病毒的相互作用，它们之间可以同时接种，也可以先后接种。而诱导抗病性是一个很广泛的概念，可以利用任何物质作用于植物，只要激发了植物潜在的抗病能力，就是诱导抗病性。 植物诱导抗病性具有以下几个特点 ： 抗病的广谱性。烟草经诱导后 ， 对 7种病原引起的病害有明显的减轻现象 ， 包括 多种真菌性病原 ， 2种细菌性病原和 2种病毒 ， 但也有例外 ，即 诱导抗病的广谱性是相对的 ， 植物被诱导后产生的抗性不能对所有病害都有防御作用 （ . A. et 1996） 。抗病的相对持久性、系统性。 1996年， 病原的系统抗性 ， 这种抗性在诱导 8天后的抗病效果与诱导中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 8小时后的一样 ， 在 2周后仍明显。黄瓜经 毒菌株诱 导后 ， 对炭疽病的抗性持续了 4 6周 （ . et 1997） 。无污染。利用病原弱毒菌株、非寄主专一性病原或病原的分泌物、细胞壁成份作为激发植物抗性的诱导物 ， 无污染、易分解 、 无残留、对人畜无害。一些化学诱导剂 ， 如草酸盐、磷酸盐、水杨酸 （ 及其衍生物本身作为植物的营养物质或组成成份 ， 显然是无公害的。一些人工合成诱导剂 ， 如 2， 6 、苯并噻唑（ 也是相对无毒或低毒的。 物系统诱导抗病性的诱导激活剂及其特征 诱导激活剂主要分为两 大类，非生物诱导剂和生物诱导剂。与传统的农药相比有以下特点：本身无离体的杀菌或抑菌作用或 仅有很低的杀菌或抑菌活性，在活体条件下才能 激活植物自身的免疫系统用以抵御病害的侵袭。作用机制复杂，不是单一作用靶标，植株整体协调产生系统的防御功能，并非传统的直接杀菌或抗 菌的模式。诱导产生的抗病性具有持效性和广谱性 的特点，传统杀菌剂的抗菌谱一般较窄，而植物抗病激活剂产生的抗性具有非专化性的特点，可 有效地控制真菌、细菌、病毒等多种病害。诱导 产生的抗病效果存在滞后性，诱导处理的植株必 须经过一段时间后才能对其他病原菌表 现出抗 性。对病原微生物没有选择压力。传统农药往往容易引起抗药性，诱导抗病性是植物本身抗性的激活，以增加自身的免疫力保护细胞免受病菌的侵害，抑制病原菌的生长繁殖。而且 激活剂自身一般没有直接的杀菌活性，不会对病原菌产生选择性。对不具有致病性的腐生菌、拮抗菌无影响， 有利于维持生态平衡和保护环境。 植物抗病激活剂与常规杀菌剂配合 使用具有协同作用。 生物诱导剂 非生物诱导剂包括物理诱导剂和化学诱导剂。作为系统诱导抗病性的化学诱导剂必须具备 3个条件，即化学物质本身及其代谢产物在离体或活体条件下无直接的 杀菌活性；该化学物质可调节植物，使其与病原菌间产生非亲和性互作；该化学物质可诱导植物产生至少对 1种病原菌的抗性。已知的化学诱导剂主要有以下几种：水杨酸（ 它可诱导多种植物对不同病原真菌、细菌及病毒产生抗性。蔡新忠（ 1997）发现苗期经水杨酸诱导可使水稻在成株期后抗稻瘟病。用 现叶面喷施只保护处理过的叶片抗霜霉病和烟草花叶病毒，但茎部注射时则诱导了对烟草花叶病毒的系统抗性。但水杨酸在实践中存在一些不足，首先外源水杨酸使用时，在植物体内迅速 转化，主要以 葡萄糖基形式存在，该物质不能在韧皮部传导，故不能被有效利用。其次水杨酸在浓度较大时对多数作物均有毒性，稍有不慎即可引起药害，故水杨酸虽为实验室研究的好材料，但仍不是田间大面积使用的理想化合物；其次是二氯异烟酸（ 其酰胺（ 1994）用二氯异烟酸处理大麦感病品种，诱导其产中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 生了对 此同时发现系统诱导抗病性的表达与病程相关蛋白（ 、过氧化物酶（ 几丁质酶的积累存在相关性。实验证明，二氯异烟酸及其酰胺在离体条件下有微弱抗菌活性，在田间和温室条件下均能很好地保护黄瓜、水稻等作物抵抗真菌性和细菌性病害。 1996年汽巴嘉基（ 司的科学家和大学教授们研究发现了 1种新的化学诱导剂 苯并噻重氮（ 称 其结构与水杨酸和酰胺有相似之处，并已经经试验证明可在多种植物，如小麦、水稻、烟草等作物上诱导系统抗病性的产生，并对多种病原真菌，如 于其具有广谱性和实用性，目前已被汽巴嘉基公司商品化生产，并在大田试验中取得良好的诱导效果。 1991）研究表明，草酸喷施黄瓜可诱导其产生对真菌、细菌和病毒病害的抗性。用草酸喷施黄瓜，不但对多种真菌产生系统抗性，而且还抗部分细 菌和病毒病害（张元恩， 1992）。张宗申等人（ 1998）用草酸处理黄瓜诱导对 明了草酸是 1种有效非生物诱导剂，并对草酸“在植物体内活性氧作为一种中间信号物质启动防卫基因表达”的假说进行了验证。此外，噻菌灵、二甲基环丙烷羧酸（ 粪浸液、聚氨基葡聚糖、诱导素（ 也可以作为激活剂诱导系统抗性。 物诱导剂 原菌弱毒菌株、非寄主专一性 病原或非致病微生物作为诱导物 用于生物诱导剂的有真菌、细菌和病毒。真菌中包括病原菌和非病原菌，病原菌中主要是弱致病力的菌株，真菌不同结构有机组分中一些不饱和脂肪酸和氧化脂肪酸也可诱导系统抗病性，如花生四烯酸、亚麻酸、亚油酸和油酸可系统诱导番茄对晚疫病菌（ 抗性， . G.（ 1991）等研究认为，花生四烯酸天然存在于晚疫病菌的孢子中，侵染后释放到植物组织中，可能具有激发孢子的作用。可用作诱导剂的细菌包括死体或活体的病原细菌和非病原细菌及细菌的不同成分， 如细菌 因产物可诱导非寄主植物产生过敏性，进而获得系统抗性。病毒本身或病毒辅助因子都可诱导系统抗性，研究最多的是烟草花叶病毒，有人还用病毒辅助因子进行试验研究。 董汉松等 （ 1995） 报道 ， 用非致病菌菌株 导烟草抗赤星病 ， 经大田实验表明 ，诱导后不但可以增加烟草对赤星病的防治效果，还能够明显改善烟叶品质。沈英等 （ 1990）以 利用紫外光照射获得的非致病突变菌株及一种弱致病的稻瘟病野生菌株为诱导物 ， 苗期喷雾接种到感病的水稻品种上 ，使 感病水稻不同程度地获得了抗病效果。李君彦等 （ 1990） 研究了非致病尖孢镰 刀菌株对西瓜枯萎病的防效。田间试验表明 ， 接种非致病菌后第 13天 ， 对照全部罹病 ， 而经诱导处理的植株防效为 94. 3 %， 至第 18天 ， 仍保持 60. 9 %的防效。而且 ， 非致病菌株接种处理还能显著中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 提高株高、真叶数、第二片真叶面积。 张硕成（ 1990）在西瓜上用非致病的 16和 317菌系土壤接种，诱导了西瓜对炭疽病的系统抗性，使其在整个生长期都有效果。 1991）研究表明 植物根圈促生细菌 （ 诱导植物对一些叶部病害的抗性。 同样，一些促植物生长的根瘤杆菌定植于植物根际或根面后 ， 也可 作为根际病原微生物的有力拮抗者 ， 是应用较多的生物防治细菌。 1996） 用不同的诱导方法研究了一种荧光假单胞菌 证明不管是根部处理还是叶部处理都一样有效地激活萝卜产生对根部病害和叶部病害的抗性，产生对 系统抗性。在拟南芥中 ， 这种菌株对一种根部真菌病原也产生同样的效果 （ MJ et 1996） 。 （ 1995） 提出 ， 用荧光假单胞菌对植物叶面诱导处理 ， 表现出有效的诱导作用 ， 特别是对根部病害与叶部病害的控制效果一样明显 ， 为它在农业生产的实际应用上提供了很大的可能性。可喜的是 ， 对 （ 1998） 研究了另外三种 B. 和 对黄瓜抗炭疽病 （ 、角斑病（ 和葫芦萎缩病 （ 的诱导抗病效果。结果表明 ， 这三种 并且有显著地促进植物生长的作用。吴洵耻等 （ 1993） 用非致病的弱毒菌株经培养制成的菌剂诱导棉花抗枯萎病 ， 经两年田间实验表明其防治效果可与化学杀菌剂媲美。国内 ， 在 80年代已开展卫星核糖核酸防治病毒病的研究 （ 包建中 等， 1998）， 用它与病毒 一定比例混合接种多种植物 ，可以 得到能使植株产生免疫作用的弱毒疫苗 ， 田间试验表明有良好的防病增产效果 ， 并且对蔬菜和大田作物是安全的。 1989）用黄瓜尖孢镰刀菌 （ 毒小种对枯萎病不同抗性的西瓜进行接种，诱导产生了对炭疽菌的局部和系统抗性。张元恩等（ 1992， 1989）用黄瓜炭疽病的弱毒株系诱导黄瓜第一真叶，获得对该病菌的系统抗性，同时还抗黄瓜霜霉菌 。但是 ， 弱毒菌株或其孢子制剂直接应用于 田间的防病效果可能会因地域、气候而异 ， 存在效果不稳定的问题 ， 而且有潜在风险 ， 其应用要以弱毒菌株与寄主互作过程中不变成强毒株为前提。 原、植物或其它生物的激发子作为诱导物 如弱毒菌株制成的诱导菌制剂、从真菌细胞壁或节肢动物外骨骼分离的几丁质和脱乙酰几丁质及降解产物 （ 聚几丁质、寡聚去乙酰几丁质、寡聚氨基葡聚糖 ）、 植物细胞的寡半乳糖醛酸以及细胞壁的成份、病原菌培养滤液或从滤液中提取的诱导物等，均可作为激发子诱导植物的防卫反应。尤其是特定组成的寡聚糖，作为植物生长发育的重要调节剂，在 植物诱导抗病中的作用和机制已引起关注。一定聚合度的寡聚氨基葡聚糖和寡聚几丁质均可有效地启动植物的抗病防卫体系 （ . C. et 1993） 。中科院大连化物所研制成功一种能防治棉花黄萎病、大豆病毒病等植物病害的活性寡聚糖生物农药，防效分别达 71%和 80%。蒋继志等 （ 2001） 研究中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 了大蒜、洋葱等 24 种植物提取物对晚疫病菌（ 诱导抗病性，发现经 8 种植物组织提取物诱导处理的块茎切片，不仅保鲜期长，而且静止孢萌发率、附着胞形成率均明显低于对照；经 8 种植物 组织提取物诱导处理的种薯在出芽、早期生长、抗晚疫病及产量等各方面均优于对照，病害保护率达 54%、增产率达 31%。特别值得一提的是，病原菌本身也有成为激发子的可能。 用烟草茎部注射烟草霜霉病菌（ 孢子囊，同时叶片接种烟草花叶病毒，可诱导产生烟草对霜霉病和病毒病的系统抗性。 et （ 1992）报道，烟草花叶病毒诱导的烟草系统诱导抗病性对病原真菌、细菌和病毒均产生广谱抗性。据 和 1977）研究，黄瓜局部接种烟草坏死病毒（ 细 菌性角斑病均（ 瓜类炭疽病菌（ 可诱导植株在几天内产生广谱系统抗性，可抗包括真菌、细菌和病毒等 13 种病害，可保护黄瓜 28 42d；若在接种后 14 21d 再进行 1 次强化接种，在整个生长季节均有抗性。 1991）用烟草坏死病毒、烟草环斑病毒（ 导了豇豆的系统抗性，首先表现为过敏性反应，认为局部坏死斑的形成对诱导系统抗性是必需的。1997）用烟草坏死病毒预接种番茄和马铃薯诱导了其 对 系的系统抗性，从而延缓了病情发展，降低了病情指数。 （ 1991）在水稻第一叶用 导接种，使植株产生了对稻瘟菌的系统抗性。朱明华（ 1990）用 黄瓜第一真叶进行诱导接种，发现处理后第二片真叶上的 6 、 4 活性升高，且木质素比对照高 2 倍。安德荣（ 1993）用烟草花叶 病毒诱导接种心叶烟、三生烟、珊西烟和蔓陀罗，可使接种植物对烟草花叶病毒、烟草环斑病毒和 侵染表现很强的抗性，该抗性具有非特异性和广谱性。 物系统诱导抗病性的可能机制 织病理学机制 植物系统诱导抗病性的诱导包括从植物细胞壁到细胞内部的一系列结构抗性反应，细胞壁强化是第 1 个环节，包括木质素沉积、乳突体形成、胶质体形成、侵填体的产生等，木质素以多种不同的方式抗病原菌的侵染（余迪求等， 1999）。一是木质素增强了寄主细胞的机械强度，使寄主抵抗病原菌所分泌的酶的降解；二是细胞壁内的 木质素限制了营养物从寄主向病原菌的扩散，从而使病原菌处于“饥饿”状态；三是木质素合成前体本身可能对病原有