【毕业学位论文】（Word原稿）亚麻耐渍资源的生理研究及耐渍基因的RAPD标记作物遗传育种硕士学位论文

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 硕士 学位论文 亚麻耐渍资源的生理研究及耐渍 基因的 记 o. I 摘 要 我国南方雨水多、田间积水严重是亚麻生长的主要限制因子，研究亚麻耐渍的生理机制及遗传机理，对我国南方 亚麻 耐渍的栽培调控和分子标记辅助育种具有重要意义。本研究以耐淹涝能力不同的 48 份品种为材料初步建立了亚麻耐渍能力的评价体系，筛选出 耐渍 型及非耐渍型品种；通过研究淹水胁迫对不同耐渍型品种农艺性状 、生理生化特性 的影响 ， 初步揭示了亚麻耐渍的生理机制；以 耐渍型品种及非耐渍型品种为 亲本进行杂交，获得 行遗传分析及 子标记研究。主要研究结果如下： (1)建立亚麻耐渍性的评价体系及耐渍材料的筛选 通过盆栽试验 ,以淹水处理与正常水分条件下株高差为标准，结合其他农艺性状的分析对48 份亚麻品种 进行耐渍性鉴定，并将亚麻的耐渍性分为强、中、弱三级，筛选出耐渍性强的品种 渍 性弱 的 品种： 余品种表现为耐渍性中等。 进一步 测定淹水处理后组培苗的株高， 从 初步筛选出的 6 个 品种 中选出最 耐渍 的材料 耐渍性最差的材料 于分子标记研究。 (2)亚麻耐渍的生理机制 表现在农艺性状上， 淹水处理 使亚麻 植株株高降低、工艺长度变短，茎秆变细，种子产量、纤维产量以及出麻率降低 ；淹水胁迫下 耐渍型品种株高、工艺长度、出麻率等降低幅度小于非耐渍型品种 ； 表现在生理生化特性上，淹水胁迫下不同耐渍型品种根、茎内部 通气组织的发生及薄壁细胞的增生是衡量亚麻耐渍性强弱的指标； 丙二醛 (积累量及稳定性体现了亚麻 植株 耐渍性的强弱 ；过氧化物酶 (性的增加体现了亚麻植株体内消除活性氧自由基的能力， 活性增加显著 说明植株对涝渍的适应性强。 (3)亚麻耐渍基因的 记 本研究 采用组培苗耐渍鉴定 的方法对 体进行耐渍性鉴定及遗传分析， 群体分离符合 3:1 或 1:2:1 的分离规律， 初步研究表 明 耐渍型亚麻品种 能 含有一个主效耐渍基因 ；根据混合群体分组分析法 (立抗、感基因池。 析中，在 500 个随机引物中筛选出一个引物 两亲本及抗、感基因池中均能扩增出一条大小为800稳定的差异条带，命名为 过 个体验证，耐渍型个体均能扩增出此差异条带而非耐渍型个体中不能扩增出此差异条带，证明 与亚麻耐渍基因紧密连锁的记。 关键词：亚麻 ,耐渍机制 ,记 in is a in on of to of it is in to an of a a by 8 of to of 1 2 as (1)up of By we K of 8 be by 3 3 on of 4 (2)of to of of on of of of of of of an of DA of OD of is in to of of by (3)to of a :1 :2:1 2 4a in 2 to 500 to of 1377 to a 00bp in 1377in 2 1377to in 录 第一章 绪论 . 1 1 植物耐涝渍生理机制研究 . 1 渍对植物体的伤害 . 1 物对涝渍的适应性 . 2 物耐涝渍的生理机制研究进展 . 2 2 分子标 记技术在作物遗传育种中的应用 . 3 子标记的原理及优越性 . 3 子标记的种类概述 . 4 子标记技术应用于作物遗传育种 . 5 子标记技术应用于亚麻遗传育种 . 8 3 离群体分组分析法（ . 9 机扩增多态性 . 9 离群体分组分析法 (. 10 术结合分离群体分组分析法 (植物抗性研究中的应用 . 11 4 论文研究 . 12 题依据 . 12 文设计 . 12 第二章 亚麻耐渍的生理机制研究 . 14 1 材料与方法 . 14 验材料 . 14 验方法 . 14 2 结果与分析 . 17 麻耐渍性的评价及耐渍材料的筛选 . 17 水胁迫对不同耐渍型品种农艺性状的影响 . 19 水胁迫下，不同耐渍型品种根、茎内部结构观察 . 19 同生育时期淹水胁迫对不同耐渍型品种生化特性的影响 . 20 3 讨论 . 22 于耐渍材料的筛选与鉴定 . 22 于淹涝对不同耐渍型品种农艺性状的影响 . 22 于亚麻耐渍的生理机制初探 . 23 第三章 亚麻耐渍基因的 记 . 24 1 材料与方法 . 24 验材料 . 24 验方法 . 25 2 结果与分析 . 28 涝胁迫下 . 28 析 . 30 3 讨论 . 35 于亚麻耐渍性鉴定的讨论 . 35 于用 法寻找亚麻耐渍基因的 记 . 35 于 应的稳定性 . 36 于 记 亚麻遗传育种上的应用展望 . 36 第四章 结论 . 37 参考文献 . 38 图 版 . 42 致 谢 . 45 作者简历 . 46 V 缩略词中英文对照 of 略词 中文名 英文名 乙醇脱氢酶 增片段长度多态性 合群体分组分析法 六烷基三甲基溴化胺 B 溴化乙锭 二胺四乙酸 达序列标签 记辅助选择 二醛 D 光密度 合酶链式反应 氧化物酶 酸吡哆醛 机扩增多态性 列特征化扩增区域标记 单重复序列 E 冲液 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 亚麻 是 亚麻科 (亚麻属 (一年生草本植物。生产上应用的为栽培亚麻 (.)，分为纤维用、油纤兼用、油用三种。亚麻科有 22 个属 200 多个种。 全世界共有 20 多个国家和地区种植纤维亚麻。 1999世界年平均种植面积为 50 多万前四位的依次是：中国 120,286罗斯 110,804 俄罗斯 74,014国68,453俄罗斯亚麻种植、收获、加工全部机械化，拥有亚麻种质资源 5000 多份，居世界第一位。 西欧 的法国、荷兰、比利时等国的亚麻生产及科研水平都处于国际领先地位，其原茎产量已经达到 6000 7500kg/维产量 1200 1800kg/ 中国是亚麻起源地之一，亚麻在中国已经有 5000 多年的栽培历史。 我国 1906 年开始试种纤维亚麻 ， 到 1936 年纤维亚麻的生产在 黑龙江、吉林两省形成了一定的生产规模。 其后纤维亚麻种植面积逐年上升。 20 世纪 40 年代，全国纤维亚麻面积 2 万 要分布在黑龙江省。 20 世纪 90 年代以来，随着中国加入 市场经济的建立及种植业结构的调整，中国的纤维亚麻得到了迅猛 发展。 1998 年在我国南方开始利用冬闲田发展亚麻生产，目前在云南、湖南、 湖北、 浙江等省已经发展亚麻 6 万多公顷。南方亚麻的发展使我国亚麻种植面积进一步扩大， 1996 世界第二位。 2004 年我国纤维亚麻的种植面积已经达到了 16 万 居世界第一位（ 王玉富， 2005）。 我国的 亚麻产品远销 120 多个国家和地区。悠久的种植历史积累了丰富的亚麻种植、沤制、加工经验，为亚麻生产的良性发展奠定了基础。 利用南方大量的冬闲田种植亚麻具有广阔的发展空间，但是由于我国南 方雨水多，田间容易积水，亚麻渍害严重，并造成了亚麻倒伏严重， 严重影响亚麻纤维的产量和品质， 亚麻耐渍问题已经成为严重制约南方亚麻生产的发展因子之一。 1 植物耐涝渍生理机制研究 渍对植物体的伤害 我国南方降雨量高， 雨量 分布不均匀，经常会出现短暂或较长时间的水涝灾害，过高的土壤含水量不利于植物的生长和发育，引起一系列的伤害甚至死亡。 涝害对植物的伤害表现在代谢紊乱、营养紊乱、乙烯增加等方面（ 潘瑞炽 ,2004）。 涝害是由于缺氧而 抑制 有氧呼吸，大量消耗可溶性糖，积累酒精；光合作用大大下降，甚至完全停止；分 解大于合成，使生长受阻，产量下降。涝害较轻时，由于合成不能补偿分解，植株逐渐被饿死；严重时，蛋白质分解，细胞质结构遭受破坏而致死。 涝害 使 土壤的 好气性细菌（如氨化细菌、硝化细菌等）的正常生长活动受到抑制，影响 矿质营养供应；相反，土壤厌气性细菌（如丁酸细菌）活跃，增加土壤溶液的酸度，降低其氧化还原势 ，使 土壤内形成大量有害的还原性物质（如 ）， 使 必须元素 也被还原流失，造成植株营养缺乏。 低氧促进番茄根部 送到茎，转化成乙烯，导致叶柄偏上生长，叶片向下生长。中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 作物在不同生育期受涝害影响的程度不同。 物对涝渍的适应性 植物是否适应淹水胁迫，很大程度决定于植物体内有无通气组织。根系是植物遭受涝渍胁迫直接危害的主要器官，极度的缺氧环境导致根系改变代谢途径和合成的依赖于 析比较不同品种的根系活力差异是鉴别其抗涝适应性一个重要生理遗传指标（ 陈大清等 ,1998）。例如水稻的根和茎具有 发达的通气组织，能把地上部吸收的氧，输送到根部，所以抗涝性就强。而小麦的茎和根缺乏这样的通气组织，所以对淹水胁迫的适应能力弱。如果小麦、玉米等根部缺氧，也可诱 导形成通气组织。淹水缺氧之所以能诱导根部通气组织形成，主要是因为缺氧刺激乙烯的生物合成，乙烯的增加刺激纤维素酶活性加强，于是把皮层细胞的胞壁溶解，最后形成通气组织。 植株淹涝时气体交换受阻和土壤因子的改变导致了无氧代谢产生的有毒物质和有毒矿质离子的积累，从而加速了根系缺氧的伤害。（ 李玉昌等 ， 1998） 有实验证明，玉米苗缺氧时形成两类新的蛋白：首先是过渡多肽 （ ，后来形成厌氧多肽 （ 。后者中有一些是糖酵解酶或与糖代谢有关的 酶，这些酶的出现会产生 应能量；也通过调节氮代谢以避免有毒物质的形成和积累（ 潘瑞炽 ， 2004） 。 植物对涝害的适应，主要表现在植物根、茎结构发生变化，植物体内各种酶（超氧化物歧化酶（ 过氧化物酶（ ）、丙二醛（ 及植物激素（脱落酸（ 乙烯、吲哚乙酸（ ）发生变化。 有研究表明，水分胁迫导致的植物细胞衰老主要是由细胞膜系统的过氧化作用引起，膜脂过氧化的主要氧化产物是丙二醛，其含量随着氧化作用的加剧而增加 (余泽高 ,2003)。水 分胁迫下丙二醛的含量与质膜透性变化呈 正相关 (张木清 ， 1996)。 物耐涝渍的生理机制研究进展 安渊等 (2004)进 行半秋眠和非秋眠紫花苜蓿品种耐涝性能研究：通过对来自国外的 28 个半秋眠和非秋眠紫花苜蓿品种耐涝性能的生物学评价和水淹后不同耐涝品种丙二醛含量比较分析，结果表明，水淹苜蓿的丙二醛含量明显高于对照，增加幅度达到 说明水淹引起苜蓿细胞膜脂过氧化作用加强、脂膜结构受到破坏、透性加大，促进细胞的衰老 ,引起植株死亡。丙二醛含量增加幅度与品种耐涝性能测定结果吻合 ,进一步说明半秋眠和非秋眠紫花苜蓿品种间耐涝性能存 在很大差异。 张祖新等 (2003)进行淹水胁迫下不同耐渍性玉米自交系根系中的酶学研究：以 4 种耐渍性存在差异的玉米自交系为材料，对淹水前后玉米根系中乙醇脱氢酶 ( 谷氨酸脱氢酶 (过氧化物酶 (表达量及其同工酶的变化进行研究，结 果表明：淹 3天后的各个自交系根系中， 活性都明显增加， 点被诱导表达；耐渍性较差的 E 活性分别增加 170%和 130%以上，耐渍性较好的自交系 性则变化不明显；除 ， 性在淹水前后变 化不明显 ,但淹水处理后有一 同工酶位点 诱导表达 ；淹水后，凤可 1 根系 性略有上升，其他材料 性均有不同程度下降。作者认中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 为，玉米根系在缺氧条件下快速进入乙醇发酵途径和氮代谢等途径 ,提供生存所需能量和减少代谢有毒中间产物积累，是玉米耐渍性的基本特征。 王文泉等 (2003)进行不同耐渍基因型芝麻在厌氧胁迫下根系的生理与结构变化研究：利用 4种耐渍性不同的芝麻基因型，在厌氧胁迫条件下检测了根部无氧呼吸酶活性、内源乙烯含量并调查了根形态和解剖结构，以比较研究旱生植物耐渍性的主要机制。结果表明：耐渍种质 的乙烯释放量在根中增加了 ，茎中 ，不定根数量增加了 ，在初生根和不定根皮层形成典型的通气组织。非耐渍种质中未检测到乙烯变化，不定根数量增加了 ，根中无明显的通气组织发生，但是乙醇脱氢酶 (活性可增加 ，高于耐渍种质。综合分析认为 ， 不定根增生和根皮层通气组织的形成是芝麻耐渍性的重要机制，根中内源乙烯的增加与结构适应变异有关。通过对不同基因型的无氧呼吸酶、根形态和结构及产量变化的研究，说明其耐渍性的主导因素 ,为进一步寻找耐渍遗传改良的目标基因 提供了依据。 陈龙等 (2002)进行灌浆期涝渍胁迫对小麦生理生化特性影响的研究：结果表明，小麦叶片在涝渍胁迫 3 天后 性急剧下降，产生了过氧化作用，致使 量升高，其升高期与 与汪宗立等 (1998)在玉米中观察到的结果相近。 李学湛等 (1998)进行渍水条件下不同抗性大豆根组织细胞结构的观察研究：渍水条件下，研究耐涝性的 “宝交 83不耐涝的 “克 8118”大豆品种根组织细胞结构变化，随着渍水胁迫强度的增加， “宝交 83水性状逐渐显露：根系多、变粗、中柱 鞘及形成层细胞分生能力较强，产生大量薄壁细胞；而 “克 8118”根系增生不明显、中柱鞘及形成层细胞分生能力较弱，皮层中的薄壁细胞空瘪、坏死、脱落。 王晨阳等 (1996)进行土壤渍水对冬小麦根系活性氧代谢及生理活性影响的研究。通过对小麦不同生育时期、不同渍水时间根系的生理变化进行系统的研究，得出：土壤渍水使根系质膜相对透性增大，膜脂过氧化产物 量增加，呼吸速率及根系活力下降；渍水过程中根系 性的变化是先增后降，但 性下降早（渍水 3 天左右）， 性下降较晚（渍水 10 天以后才由峰值下降 ）。根系 变化与其膜脂过氧化有关，随着 性的下降，膜脂过氧化加剧，质膜透性明显增大；当 性下降时，根系质膜结构已遭严重破坏，生理功能显著衰退。不同时期根系对渍水的耐性不同，耐渍力随生育期的推进而逐渐减弱。根系呼吸代谢所利用的氧，主要是土壤空隙中的自由氧和土壤水中的溶解氧。在渍害发生后，根系呼吸只能利用低量的溶解氧，因此呼吸代谢受抑，呼吸速率下降。 2 分子标记技术在作物遗传育种中的应用 子标记的原理及优越性 分子标记是以 态性为基础的标记，包括 记、 卫星 卫星 记等。在遗传中使用的分子标记大致分为三类，一类是以分子杂交技术为基础的 记，主要有限制性片段长度多态性标记（ 可变数目串联重复序列标记（ 原位杂交（ ；另一类是以聚合酶链式反应（ 基础的各种 纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性 (表达序列标签（ 反转中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 录转座子等。 分子标记与传统遗传标记相比具有以下优越性： 1)直接以 形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不 受季节、环境限制，不存在表达与否的问题； 2)数量极多，遍及整个基因组； 3)多态性高，自然存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料； 4)表现为 “中性 ”，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁； 5)有许多分子标记表现为共显性 (能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息 (贾继增， 1996)。 子标记的种类概述 一项利用放射性同位素 (通常用 非放射性物质 (如地高辛等 )标记探针，与转移于支持膜上的基因组 限制性内切酶消化 )杂交，通过显示限制性酶切片段的大小，来检测不同遗传位点等位基因变异的一种技术（ 980）。 记呈共显性，探针极多，因而检测的遗传位点也非常多（ D,1989）。记主要应用于各种作物遗传连锁图的绘制和目标基因的标记（ E,1994）。但是由于 记对 需要量较大 (5 10g)，需要的仪器设备较多，技术也较为复杂，因而目前尚难直接用于育种。 是 1990 年由美国杜邦公司的科学家 导的两个小组几乎同时发展起来的一项基于 理的新技术。 指以一个通常为 10 个碱基、碱基序列随机排列的寡核苷酸序列为引物，利用对基因组 机扩增来鉴别多态性 过程（ ， 1990）。 记分析具有不需针，用一个引物就可扩增出许多片段，技术简单，分析只需少量 品，成本较低等优点；但 记一般是显 性遗传，重复性不太高，由于存在共迁移问题，在不同个体中出现相同分子量的扩增带后，并不能保证这些个体拥有同一条 (同源 )片段。 为简单序列重复，又称微卫星，是一类由 1 6 个核苷酸为重复单位组成的、长达几十个核苷酸片段的串联重复序列，如 (n、 (AT)n、 (n 等。重复序列两端多是保守的单拷贝序列，因此可以根据两端序列设计一对特异引物。 多态性通常是构内部重复单元的数量变化或重复单元序列变异引起的。 有很多优点： 1)高水平的等位基因多样性，在栽培水稻发现，每个 点有 2 25 个等位基因； 2)高多态性，由于 检测到多态性的机率高； 3)单位点， 点是单拷贝； 4)具有一定的通用性； 5)呈共显性标记； 6)引物序列在物种内通用， 有利于各个实验室之间的交流。同时 须针对每个染色体座位的微卫 星发现其两侧的单拷贝序列，才能设计出相应的引物，因而给 记的开发带来一定的困难。 扩增片 段长度多态性技术，是由 由 展起来（ ， 1995）。这种方法由于结合了 优点，具有比大的优越性 (， 1993)。 优点包括： 1)用于 析的限制性内切酶与选择性碱基组合的数目和种类很多，因此理论上 以产生的标记数目是无限的； 2)认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术； 3)现孟德尔式的遗传； 4)分辨率高； 5)假阳性低，可靠性高； 6) 第一章 绪论 5 分 析的大多数扩增片段与基因组的单一位置对应，可用于分析基因组 克隆相应的 作为遗传图谱和物理图谱的位标和联系二者的桥梁。同时 有一些缺点，此技术用于分析的试剂盒价格昂贵，分析成本高，并且对 纯度及内切酶质量要求也比较高。 近年来，一些新型分子标记大量涌现，如单核甘酸多态性 (表达序列标签（ 由据库开发的 及 阵列等（田清震， 2002）。 单核苷酸多态性 (指 同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失、突变等 ,它又被称为第三代多态性标记。 在人类基因组中大约 1000因此可以作为基因特异性的标记。借助于 如果能将所有 就可制造 “基因组扫描仪 ”,用来扫描各个个体并分析它们在基因组成上的差异。 表达序列标签（ 是从已建好的 5末端或 3末端对插入的 获得的约 60 500为 究人员更容易在 1994)。 于基因图谱的构建。 00 300自 非翻译区的 于基因图谱的绘制（赵志辉等， 2005）。 不同分子标记各有优缺点， 应针对不同的对象和研究目的选择合适的分子标记，同时，分子标记的选择还应考虑到 量少，标记（探针和引物）的获得，技术的掌握程度及试验费用等。此外，分子标记必须与传统试验技术相结合，与育种实践相结合，才能最大限度的发挥其功效。 子标记技术应用于作物遗传育种 用于遗传图谱构建和基因定位及克隆 遗传图谱是植物资源、遗传育种及分子克隆等许多应用研究的理论依据和基础。与经典遗传作图相比 ， 分子标记技术是构建作物遗传图谱的一种较为简便快捷的理想方法。遗传图谱构建过程主要包括： 1)选择和建立适合 的作图群体； 2)确立遗传连锁群； 3)基因排序和遗传距离的确定 (李雪林 ,2004)。 个月时间就构建了玉米的 得到 1032个标记； 加了 36个 木薯的连锁图更加高密。在建立起完整的高密度的分子图谱后，就可以定位感兴趣的基因。 基因定位就是将具有某一表型性状的基因定位于分子标记连锁图中 , 实现分子连锁图与经典连锁图的整合 (马三梅 ,2001)。基因定位包括质量性状基因定位和数量性状基因定位，作物许多重要的经济性状是受微效多基因控制的数 量性状。 80年代以前 , 数量遗传学家曾用经典的形态学和细胞学标记法来研究与标记相连锁的个别数量性状，定位数量性状基因 ( 植物 吴敏生 ,2000)，现已在番茄、玉米、水稻、大白菜等 20多种作物上绘出 100多个数量性状的 冯宗云 ,1998)。中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 标记定位法、区间作图法、复合区间作图法。在构建 同时使用几种方法，并优先标定共同发现的 可 合并估计 克隆基因是遗传标记和基因组作图最重要的应用之一。许多重要基因只有在克隆后，才能加深对其基本功能的了解并对其实施修饰以创造新的表型，以及实现其在不同品种或物种间的转移。由于许多重要基因的产物及表达调控特性尚不清楚，其突变体也难以确定或创造，因此，不能用根据基因产物如蛋白质序列的克隆方法和相减杂交法等来克隆这些基因。 随着高密度遗传图谱和物理图谱的构建 , 基于作图的克隆法已成为可能。其过程为首先鉴定与目的基因连锁的分子标记 , 利用高信息量的分子标记技术比较基因组作图等基因研究的新技术 , 能够在目标基因的侧翼得到连锁非常紧密的标记，然后由这些标记去筛选大片段 鉴定出与标记有关的克隆 , 继之以亚克隆和染色体步移 (得含目的基因的克隆片段 , 最终再辅之以转化和互补测验加以验证。近年来 , 运用基于图谱的克隆技术已分离到了大量的作物抗性基因。 用于分子标记辅助选择