【毕业学位论文】（Word原稿）白菜类作物硫代葡萄糖甙及一些主要代谢组分的遗传分析蔬菜学博士论文

密级 ： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 白菜类作物 硫代葡萄糖甙及 一些 主要 代谢 组分 的遗传分析 I 摘 要 白菜类作物 (我国重要的芸薹属蔬菜作物和油用作物，由于它具有复杂的遗传基础，使得一些重要农艺性状的改良非常困难，同时，由于其悠久的栽培历史，形成了很多的栽培种群和丰富的遗传变异，也为重要农艺性状的改良提供 了广阔的资源材料。随着人们生活水平的提高，品质育种逐渐得到重视，但是，许多重要商品品质性状和硫代葡萄糖甙含量等营养品质性状遗传规律缺乏系统分析， 因此 有必要从代谢组和分子水平上 对白菜类作物进行营养性状的遗传分析，为改良白菜类蔬菜的营养品质和培育高有益硫甙葡萄糖甙的白菜类作物新品种提供理论基础， 为发掘 并利用关键性基因 资 源 奠定基础。 本研究 采用 白菜类作物苗期植株硫甙含量进行了评价，为进一步开展硫甙在白菜类作物中的积累和遗传研究提供信息；在筛选合理亲本的基础上，创建了遗传信息丰富的遗传研究分离群体， 构建了白菜类作物遗传连锁图谱框架图；并进一步开展了硫甙含量的 根据拟南芥和马铃薯应用气 立了大白菜球叶冷冻真空干燥样品应用气 定了 仪器分析的相关参数，并对大白菜主要代谢组分进行了鉴定和遗传分析。获得的主要结论如下： 1 利用 析了 8 种硫甙的含量，白菜类作物苗期植株体硫甙含量存在一定的自然变异。材料间硫甙含量差异最大达到 1127 倍（ 量），其它各硫甙组分含量材料间的变异幅度为 18，总 硫甙含量最大相差 51 倍。不同白菜类作物种群间硫甙含量有一定差异，同一栽培群不同材料间硫甙含量也存在一定差异。同时，对硫甙合成途径中关键基因 白菜类作物中的变异进行了分析。 2利用欧洲油用型白菜 菜心品种 种间杂交建立的 建了包括 17 个连锁群、由 129 个 记和 27 个 记共 156 个标记的遗传连锁图谱，覆盖基因组长度为 719.2 记间平均图距为 4.6 间，连锁群上的标记数为 3。 3 采用区间作图和多 合作图方法对白菜类作物硫甙含量进行了 位及遗传效应分析。在 体遗传图谱的 6 个连锁群上，共检测到 14 个 制单一脂肪族硫甙和总脂肪族硫甙的 11 个，其中控制 量的 ，控制 量的，控制 量的 ，控制总脂肪族硫甙含量的 ， 控制 2 个 。控制吲哚族硫甙 4量的 ，控制芳香族硫甙 量的 献率范围为 4优化并确定了 大白菜代 谢组分分析体系， 根据已建立的分析体系对大白菜 体的 183 个单株使用 行了代谢组分的测定，可以进行准确统计代谢组分有 47 个峰 , 这些代谢组分分为 6 类物质，分别为有机酸、糖类、氨基酸、糖醇、糖苷和芳香胺。其中有机酸 13 个，糖类 16 个，氨基酸 2 个，糖醇 6 个，糖苷 2 个，芳香胺 1 个。 对所得的代谢组 进行了 析，利用多 型作图法，共发现了控制 20 个代谢组分的 33 个 布于 9 个连锁群，贡献率范围为 关键词 ：白菜类作物，硫代葡萄糖甙，代谢组分，分子遗传图谱，数量性状 位点 is an of a of of it to On of to of of as in So of . at a of be to . In we of by in to of we . It be to . on of . of as 1. 8 to be in . in in in 127 of in 8of in 1 or in 2. by a 144 a 58. 156 7 a .6 of 1.7 cM 8.7 cM of to 5. 3. in TL 14 TL 3 1 2 1 2 1 of 4. of at on 47 IV In a 3 0 3 of V 目 录 第一章 文献综述 . 1 1 十字花科植物硫代葡萄糖甙的相关研究 . 1 代葡萄糖甙及其降解产物 . 2 代葡萄糖甙降解产物的生物活性 . 3 代葡萄糖甙的测定方法 . 4 代葡萄糖甙在拟南芥上的研究 . 7 2 代谢组学及其在植物中的研究进展 . 9 谢组学及其发展过程 . 9 谢组学与其它组学的关系 . 10 谢组学研究成为功能基因组学研究重要组成部分的必然性 . 11 谢组学的研究现状及应用领域 . 11 谢组学的研究方法 . 13 3 白菜类作物分子标记研究进展 . 13 菜类作物遗传图谱研究 . 13 菜类作物基因定位研究 . 17 4 本研究的目的与意义 . 22 第二章 白菜类作物硫代葡萄糖甙的自然变异 . 24 1 材料与方法 . 24 验材料 . 24 验方法 . 25 2 结果与分析 . 25 菜类作物硫代葡萄糖甙的 测定 . 25 代葡萄糖甙在白菜类作物中的分布及变异程度 . 26 3 讨论 . 39 4 小结 . 40 第三章 硫甙合成途径 因 在 白菜类作物中的分布及变异 . 41 1 材料与方法 . 41 验材料 . 41 验方法 . 42 2 结果与分析 . 44 因的扩增 . 44 因在白菜类作物中的聚类分析 . 46 菜类作物中 . 47 3 讨论 . 50 因在白菜类作物中拷贝数的分析 . 50 因的变异与白菜类作物脂肪族硫甙含量的关联分析 . 50 4 小结 . 51 第四章 白菜类作物分子遗传图谱的构建及硫代葡萄糖 甙的 位 . 52 1 材料与方法 . 52 料 . 52 法 . 53 2 结果与分析 . 55 记和 记多态性 . 55 子标记的分离分析 . 57 子遗传图谱的构建与分析 . 57 代葡萄糖甙的 析 . 62 3 讨论 . 67 子遗传图谱的构建 . 67 种硫甙含量的 . 67 4 小结 . 68 第五章 大白菜复杂代谢组分分析方法的建立及遗传分 析 . 69 1 材料与方法 . 69 验材料 . 69 验方法 . 70 2 结果与分析 . 72 白菜 体遗传连锁图谱 . 72 白菜复杂代谢组分分析方法的建立 . 73 白菜代谢组分的遗传分析 . 79 叶色、种皮颜色相关代谢组分和种子油份的遗传分析 . 85 3 讨论 . 89 白菜遗传连锁图谱 . 89 白菜复杂代谢组分分析方法的建立 . 89 白菜代谢组分类别的鉴定 . 90 白菜各种代谢组分的 . 90 大白菜叶色、种皮颜色相关代谢组分和种子油份含量的 . 91 4 小结 . 92 结论 . 93 参考文献 . 94 致谢 . 104 作者简历 . 105 略 语 as 效液相色谱 留时间 代葡萄糖甙 343 3 乙基硫甙 43莲葡糖硫苷 交自交系 关序列扩增多态性 位区域 扩增多态性 传连锁图谱 量性状位点 TL 模型 图 中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 白菜类作物属于（ ., 染色体组 2n=2x=20）十字花科（ 薹属（ 包含许多重要的蔬菜和油用作物。该作物在世界各地具有悠久的栽培历史，遗传资源丰富。 我国是 白菜类蔬菜和白菜型油菜的起源和演化中心之一。白菜类蔬菜作为比较早的栽培植物 ,主要包括大白菜、小白菜 、芜菁、菜薹等多个栽培变种，是中国分布最广，种植面积 最大的蔬菜类作物，尤其在我国北方消费量最大，栽培最为广泛。仅大白菜和小 白菜每年栽培的总面积就在 310 万公顷以上，占全国蔬菜年供应量的 20%，是我国人口所需营养的重要来源之一， 在居民的膳食结构中具有十分重要的地位。 另外，作为世界主要油菜类型之一的白菜型油菜具有耐瘠薄、耐干旱、抗寒性强 ， 特别是生育期短等优良性状 ， 在我国西北高原各省区、长江流域各省区水稻与油菜的轮作 中 , 具有甘蓝型油菜所不可替代的作用。 1 十字花科植物硫代葡萄糖甙的相关研究 十字花科植物的主要活性成分为硫代葡萄糖甙 （ 简称硫甙， 十字花科植物中 一种含硫的阴离子亲水性 次生代谢产物（ 目前已发现的硫甙有 130多种，存在十字花科蔬菜中的大约有 15 种。 在已发现的十字花科蔬菜防癌物质中， 卜硫素）（ et 1995； et 2002）能调节机体关键的 酶（ I 酶 （如 ） 的活性，使机体的遗传物质免受损伤。特别值得注意的 硫甙 4降解产物，结构为 是迄今为止发现的最强烈的 I 酶诱导剂（ et 1998），它能使致癌基因失去作用（ 硫甙的降解产物 还 是构成十字花科蔬菜特殊辛香风味的主要来源，不同的异硫氰酸 酯构成了十字花科蔬菜特殊的风味（ et 2004）， 如白菜类的清鲜味、甘蓝类的苦味及萝卜的辛辣味主要由于不同硫甙 3 甲状腺肿素前体）和43降解产物形成的。硫甙的降解产物还可作为天然的抗虫、抗菌剂，也和昆虫的繁殖、预测有关。但是，某些硫甙如致甲状腺肿素前体在水解后，重排形成环状的噁唑烷硫酮（ 5致甲状腺肿素 ， 这种物质会抑制动物对碘的吸收而导致甲状腺机能障碍。一些腈类对肝、肾有损害作用。另外 ， 硫甙水解产生的特殊芳香物质不仅是十字花科作物特殊风味形成的主要物质，还决定着多种重要昆虫取食和产卵的趋向性。 随着人民生活水平的提高，蔬菜的营养品质日益受到关注。然而，不同硫甙组分复杂的生物学效应在一定程度上限制了硫甙的有效利用。另外，一些有害硫甙的大量存在也限制了油菜菜籽饼在饲料上的应用。研究硫甙在 白菜类作物中的含量及分布，了解其 遗传 代谢途径 ，将有助于了解芸薹属蔬菜中微量营养成分在人类日常膳食中的贡献，以提高营养 元素的有效吸收 ，并 为进一中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 文献综述 2 步研究油菜籽饼粕的营养成分奠定理论基础。 因此， 利用现有的白菜类作物遗传资源，掌握硫甙在白菜类作物中的分布情况，筛选出优良的基因资源，结合 硫代葡萄糖甙 的 合成途径，人为操纵硫代葡萄糖甙合成种类和数量， 为 提高 白菜类作物 营养品质 育种的进程， 为功能食品的开发和人类健康具有重要 的现实意义和理论 意义。 代葡萄糖甙及其降解产物 所 有的硫代葡萄糖 甙 都有一个核心结构是 据侧链 R 的氨基酸来源不同 ， 可以将硫代葡萄糖 甙 分为脂肪族硫代葡萄 糖 甙(侧链来源于蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸 )， 芳香族硫代葡萄糖 甙 (侧链来源于酪氨酸和苯丙氨酸 ) 及吲哚族硫代葡萄糖 甙 (侧链来源于色氨酸 )，图 1示三种硫甙的结构。 不同的侧链决定了水解产物的不同 ，生物 活性也存在 很大 差别 (et 1999; et 2000) 。 图 1代葡萄糖甙 酶系统 完整植物中， 硫代葡萄糖 甙 定位于细 胞的液泡中，其降解酶葡萄糖硫 甙 酶（ 定位于特定的蛋白体中 (et 1998; et 2001)。在正常情况下，酶和底物是分离的。当植物组织和细胞受到损伤时，这种酶就会从它贮藏的组织中被释放出来，并很快将硫代葡萄糖 甙 水解，脱去葡萄糖和硫酸，并在不同的条件下通过非酶化重组反应，形成几种不同的中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 文献综述 3 降解产物 (2005)。一般在 ，且亚铁离子存在的情况下形成乙腈；在 8 的情况下形成硫代氰酸盐；而在 的范围内，即 中性环境下易形成异硫代氰酸盐（ 硫代葡萄糖 甙 降解的最主要产物，并且与十字花科蔬菜独特的风味和芳香有密切关系。 硫代葡萄糖 甙 在无酶 (如加温、加压 )的条件下也会发生降解 ， 其降解过程十分复杂 ， 主要产物是腈类化合物和异硫氰酸酯 ， 反应产物和反应速度与外界条件有关。温度高 ， 降解反应速度快 ，生成腈的量大。硫代葡萄糖 甙 的反应速度与体系的含水量有关 ， 体系的含水量低 ， 则 要在较高温度下 才能 发生反应 ， 且降解反应速度较慢。碱性化学试剂和过渡金属离子都可催化硫代葡萄糖 甙的降解反应 ， 反应速度随碱性试剂的浓度增加而加快 ； 加压硫代葡萄糖 甙 的反应速度会加快。 代葡萄糖甙降解产物的生物活性 完整的硫代葡萄糖 甙 既 无毒性也无生物活性 ，其生物活性作用是经过水解之后的产物表现出来的。硫甙降解产物 的生物活性主要包括以下四个方面： 营养效应 作为牲口的饲料和人类的食品，硫代葡萄糖 甙 的降解产物长期以来被认为是有毒的，哺乳动物食用硫代葡萄糖 甙 具负营养效应。在高浓度下，一些含 羟基的硫代葡萄糖 甙 的降解产物可导致甲状腺肿大，抑制酪氨酸碘化，干扰碘吸收，造成代谢紊乱；异硫氰酸盐等物质气味辛辣，对皮肤黏膜有强烈的刺激气味，导 致“细胞内窒息”、呼吸麻痹、肺水肿、恶心、呕吐等乃至中毒死亡；腈类易导致肝、肾肿大与变性，硫 甙 含量过高情况下尤其如此。 在油菜上 此种效应 表现尤为突出 ，极大地限制了油菜籽粕在饲料上的应用 (王庆仁等， 1998)。 与植物防卫反应和化学传导 硫 甙 硫 甙 酶系统是组织损伤所活化的化学防卫系统。硫 甙 的降解产物在抵御食草动物、害虫和病原微生物的防卫反应发挥重要作用。天然形成的 有抗细菌、抗真菌和抗微生物的活性，并且可能在植物抵御微生物、昆虫和软体动物中发挥重要作用。另一方面，硫 甙 及其降解产物在植物与寄 主的识别中发挥作用，一些挥发性的 作为摄食或产卵的刺激物吸引十字花科植物的害虫。此外，吲哚类硫 甙 及降解产物还与十字花科植物中危害最大的真菌性病害 根肿病的发 病 有关 (et 2000)。 在油菜上，早期培育的低流 甙 品种（系）因植株硫 甙 水平降低，潜在的自身保护功能下降，对病、虫、畜的抗逆力削弱，且某些野生动物对幼苗的过量采食，硫 甙 在动物体内经水解后产生大量甲硫半胱氨酸亚砜（ 起中毒甚至死亡而带来某些生态问题。 中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 文献综述 4 节生长素的代谢 在大多数高等植物中，吲哚乙酸 （ 生物合成是通过色氨酸，经过吲哚丙酮酸或色氨到吲哚乙醛，最后再由吲哚乙醛氧化形成 字花科植物中 合成比较特殊， 物前体为吲哚 3 乙腈（ 腈水解酶的作用下形成 拟南芥中已克隆到 4 个编码腈水解酶的基因。在这一类植物中，吲哚类硫 甙 可被葡萄糖硫 甙 酶水解形成 因此，吲哚类硫 甙 很可能参与调节十字花科植物的活性生长素的水平。 癌作用 虽然有些硫 甙 降解产物具有毒性，但有些硫甙的降解产物 却具有抗癌作用，研究表明抗癌效应主要是由于吲哚族硫甙降解产生的 含有甲基亚磺酰烷侧链的 很强的抗癌活性。 特别值得注意的 硫甙 4降解产物， 是迄今为止发现的最强烈的 I 酶诱导剂（ et 1998; 汪俏梅， 2003），它能使致癌基因失去作用（ 这一类天然的 迄今为止已知的 预防 癌症因子中最有效的一类。许多临床学研究表明，食用十字花科蔬菜可有效调节致癌代谢，减少癌症的发生。 代葡萄糖甙的测定方法 由于 硫甙 的 重要性，近年来 根据不 同的原理 已经研究了多种测定硫甙的方法。 接测定硫 甙 化钯法 此法是由西德哥廷根大学 出的，早期的方法简单、快速，但由于硫 甙 钯沉淀影响了比色和观察，色阶不明显，定