【毕业学位论文】（Word原稿）麦长管蚜取食诱导小麦防御反应的生化及分子机制农业昆虫与害虫防治硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 麦长管蚜取食诱导小麦防御反应的生化 及分子机制 n n I 摘 要 虫害 诱导 的植物 防御 反应 是 昆虫 作 机理 的重要内容 。 本研究 以 麦长管蚜 小麦 作为研究体系 ， 分别 从生化水平（酶活力测定）和 分子水平 上 （以 荧光定量 主要研究手段 ）研究 了蚜虫 取食 、 蚜虫取食诱导的挥发物及其活性组分 作用下信号 传导 途径关键酶 （ 脂氧合酶 多酚氧化酶 丙氨酸解氨酶 活力及 防御 基因 （ 法尼烯基式合成酶 基因 苯丙氨酸解氨酶基因 二烯氧化物合成酶基因 转录水平的变化， 并同时以机械损伤、机械损伤诱导的挥发物以及化学诱导剂（茉莉酸和水杨酸甲酯）作为对比，最终确认了 蚜虫取食、蚜虫取食诱导的挥发物 所激发的 小麦防御 反应和防御 途径 的类型。研究 结果如下： 蚜虫取食诱导 了茉莉酸 、 水杨酸 信号传导 途径 防御 关键酶活力 显著增加 ， 并且 两条 信号传导途径 关键酶基因表达 量 与对照相比 明显 升高。 由此推断：蚜虫取食既激活了茉莉酸介导的信号传导途径，也激活了水杨酸介导的信号传导途径； 机械损伤 与 蚜虫取食 并不完全相同。 蚜虫取食诱导的挥发物 只对邻近植株中 脂氧合酶 活性有明显的诱导作用 ， 并且 能够激发全部三个防御基因 表达量升高，其机制 可能 是 通过改变 活性而激活类十八烷途径并随后启动防御基因的转录转译； 挥发物活性组分中的 6522够激活 防御基因 表达 ，而且影响蚜虫的取食和 种群数量 。 本项研究对于小麦诱导抗性的快速分子检测技术平台的建立、小麦诱导抗性机制的进一步研究以及开辟利用以挥发物和化学诱导剂为主的麦蚜防治新途径具有重要的理论和实践意义。 关键词 : 麦长管蚜， 荧光定量 发物 ，信号 传导 途径 of to in we as to of 1,3of of at of by we in by as of to A) of in we A) OX in of is OX by A of A E)to of on of of of of 录 第一章 引言 . 1 害诱导的植物防御反应信号传导途径 . 1 于昆虫的特异性激发子 . 1 害诱发的信号传导途径 . 2 莉酸和水杨酸在诱导防御中的作用 . 3 号途径之间的交互通讯 (. 4 虫取食诱导的挥发物的生物合成 . 5 类化合物 . 5 6挥发物 . 5 吲哚 . 6 发物的生态学功能 . 6 导防御信号传导的分子检测技术 . 7 时荧光定量 定量原理 . 7 时荧光定量 术优点 . 7 时荧光定量 用现状 . 7 究的目的和意义 . 8 第二章 不同处理下小麦防御途径关键调控酶活力变化 研究 . 9 料与方法 . 9 试材料 . 9 试虫源 . 9 麦诱导处理方法 . 9 要试剂及制备方法 . 10 导防御反应关键酶活力测定 . 10 验流程图 . 12 果与分析 . 13 虫取食对防御酶活力的影响 . 13 械损伤对防御酶活力的 影响 . 14 莉酸对防御酶活力的影响 . 15 虫取食诱导的挥发物对防御酶活力的影响 . 17 论与 讨论 . 18 第三章 不同处理下小麦防御途径关键酶基因表达变化 研究 . 19 料与方法 . 19 试材料 . 19 供试虫源 . 19 要试剂 . 19 要仪器设备 . 20 麦的诱导处理方法 . 20 御途径关键酶基因片段的克隆 . 20 御途径关键酶基因的荧光定量 件优化 . 26 验流程图 . 29 果与分析 . 30 御途径关键酶基因片段的克隆 . 30 御基因的荧光定量 件确定 . 34 同处理对防御基因表达的影响 . 36 论与讨论 . 42 虫取食所诱导的防御反应途径 . 42 虫取食诱导的挥发物激发的防御反应途径 . 43 械损伤与蚜虫取食的区别 . 43 子检测技术 (荧光定量 灵敏性 . 44 第四章 特异挥发物对小麦防御途径关键酶基因表达的 影响 . 45 料与方法 . 45 试材料 . 45 试虫源 . 45 要试剂 . 45 麦的处理方法 . 45 验流程图 . 47 果与分析 . 48 异性的挥发物对防御基因表达的影响 . 48 异性的挥发物对蚜虫取食和生长发育的影响 . 49 论与讨论 . 50 第五章 全文结论 . 51 同处理下小麦防御关键调控酶活力测定 . 51 索了小麦防御反应关键酶基因荧光定量 增条件 . 51 同处理下小麦防御关键酶基因表达测定 . 52 一步工作计划 . 53 参考文献 . 54 致 谢 . 60 作者简历 . 61 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 莉酸 杨酸 尼烯基式合成酶 丙氨酸解氨酶 二烯氧化物合成酶 氧合酶 杨酸甲酯 杨羟肟酸 酚氧化酶 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 在漫长的植物 物 进化形成了一系列抵御昆虫危害的策略来影响昆虫的定居、取食、产卵、生长发育以及生殖 行为 。 这些防御策略可以分成两类：组成型防御和诱导型防御。组成型防御是指在植物中原本就存在的阻碍昆虫和病原菌侵染的物质，既包括阻止病原物和昆虫危害的物理障碍 (如细胞壁、胼胝质、木质素 )和毒素 (单宁酸、芥子油苷、含氰苷等 )，也包括贮存在植物体内的抑制昆虫聚集的种间感应化合物 ( ， 2000)。诱导型防御则是由昆虫诱导产生的，既包括直接防御 增加有毒的次生代谢物或产生防御蛋白 （如蛋白酶抑制剂 酚氧化酶 氧合酶 氧化物酶、几丁质酶、 3 葡聚糖酶、病程相关蛋白 ） 而 对昆虫的生理代谢产生不利的影响，也包括间接防御 释放挥发性化合物吸引天敌 来 控制昆虫的数量并同时对邻近植株产生影响。组成型可以为植物提供持久的抗性保护，而诱导型防御则不同。通常情况下，诱导型防御的水平极低，一旦外界胁迫 (如病虫危害、机械损伤等 )来临时，诱导防御就能在几天甚至几小时内迅速发挥作用。不论是持续性表达的组成型防御还是暂时性表达的诱导型防御，都是以消耗能量为代价的 (， 1999)。植物必须将供营养生长和生殖生长的碳源和氮源用于其防御机制，所以很明显，与组成型防御相比，诱导型防御具有更高的 能量利用效率，是一种更为经济有效的防御机制。因此植物的诱导防御也受到了越来越多的重视， 并 在生理、生化、化学生态和分子生物学等方面取得了很大的进展。本文将集中围绕虫害诱导的信号传导途径、挥发物的生物合成、挥发物的生态学功能、实时荧光定量 国内外研究进展进行综述； 并对本文研究目的和意义进行阐述。 害诱导的植物防御反应信号传导途径 于 昆虫的特异性激发子 植物诱导防御反应途径分为三个层次：激发 防御基因表达。激发是在激发子参与下完成的。所谓激发子是一 类能诱导寄主植物产生防御反应的特殊化合物的总称。激发子分为外源激发子、内源激发子和非生物激发子。外源激发子包括植物受到创伤、昆虫取食为害、病原物侵染以及从病原物或其他微生物中提取的激发子，例如： 3 葡聚糖，脱乙酰壳多糖，半乳糖，富含甘露糖的糖蛋白，花生四烯酸等。内源激发子包括寄主植物 昆虫、寄主植物 病原物互作后释放的激发子，如水杨酸（ 茉莉酸 （ 乙烯（ 。非生物的激发子包括重金属，表面活性剂，抗代谢物等 (， 1989)。激发子与特异的细胞受体相结合，将细胞外的 信号传递到细胞内，从而启动细胞内的信号传导途径，继而激活防御基因的表达，最终产生防御蛋白和其他防御相关物质。 昆虫取食所产生的信号是 十分 复杂的，许多信号都可以激发植物的防御反应。任何来源于昆虫并与植物在细胞水平上相互作用的物质都是潜在的信号物质。昆虫的口腔分泌物和回吐物中能产生激发子而激发植物防御反应 。 目前，昆虫口腔分泌物中的两类激发子已经被确认能够诱导挥发物的产生。一类为 3 葡聚糖酶 ： (1995)将大菜粉蝶 虫口腔中的 3 葡聚糖酶应用到甘蓝叶 片的机械损伤部位 后 可诱导挥发物 的释放 ， 此挥发物 能吸引其中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 寄生蜂 外，此酶可通过抑制 号传导途径或抑制 其它信号途径之间的联系而抑制植物体内烟碱的合成（ 2002）。另一类激发子为一种脂肪酸和氨基酸的偶联物 17 是由 （ 1997） 在甜菜夜蛾 口腔 中发现的 。 由昆虫和植物共同作用而合成的，其中 7来自于植物， 理和 蠋 取食一样，都能诱导玉米释放萜类物质和吲哚 (， 2001)。在从甜菜夜蛾分离鉴定出 ，陆续又有其它具有生物活性的脂肪酸和氨基酸的偶联物如 鳞翅目昆虫的回吐物中分离出来，如烟草天蛾中， 2001）。但是 并不总是有活性的，利马豆对这种偶联物就不敏感（ ， 2001）。 关于昆虫激发子的作用机制，普遍认为存在激发子的受 体。最近，玉米中的一种质膜蛋白被证明可能具有结合 活性，因为经过标记的 茉莉酸甲酯 甜菜夜蛾处理 的 植株 上 都表现出对此种质膜蛋白的结合活性（ ， 2004）。但是具体的诱导机制仍不清楚。 害诱发 的信号传导途径 莉酸 (导的信号传导途径 大量研究表明， 导的信号传导途径即类十八烷途径是虫害和创伤诱导的主要途径。植物受昆虫取食危害后，细胞膜脂释放亚麻酸，亚麻酸在 脂氧合酶 作用下生成 13(s)亚麻酸 (13其在丙二烯氧化物合成酶（ 丙二烯氧化物环化酶（ 用下生成 1212再经 12原酶作用和三次氧化最后生成 如 ， 2001）。 成之后与膜上的受体相结合而启动防御基因的转录转译以及其他由 导的反应，并由此产生防御蛋白或防御酶如蛋白酶抑制剂 (多酚氧化酶 (脂氧合酶 ( 氧化物酶、 几丁质酶、 3 葡聚糖酶、病程相关蛋白 ( 吲哚、 （ ， 1997）。 关于亚麻酸释放之前的早期信号途径， （ 2005）在前人工作的基础上总结出了一种可能的机制： (1) 来自昆虫的胞外信号 (激发子 )的识别， (2) 膜的去极化和胞内 放， (3)蛋白激酶活化， (4) 细胞膜上亚麻酸的释放和随后的类十八烷途径的激活。但是，植物在受到危害时可能同时产生多种信号， 并且 蛋白存在着磷酸化和去磷酸化的转化，信号途径 又 具有反馈调节的特点，因此，其真正的作用机制还有待进一步研究。 物合成过程中所涉及的酶 不但是 成的关键酶 ， 同时也是植物诱导防御的重要物质。 如昆虫取食西红柿叶片后， 性迅速升高， 导致 甜菜夜蛾发育 减缓 。这是因为 坏了甜菜夜蛾的 重要营养物质 ， 1999）。亚麻的 0血红素蛋白，过量表达亚麻 转基因烟草 其 内源 水平增加（ 1995），这 也 为 物合成过程中的调控作用提供了依据。 昆虫取食诱导产生的防御物质主要是蛋白酶抑制剂 多酚氧化酶 ， 1999）。许多研究均以蛋白酶抑 制剂 因的 表达作为产生创伤反应的标志。当昆虫取食时，蛋白酶抑制剂同时被摄入，它与昆虫消化道内的蛋白酶作用形成酶 显著抑制肠道内蛋中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 白水解酶的活性，影响食物中蛋白质的消化，扰乱昆虫的正常代谢，最终导致昆虫因饥饿而死亡（ 于飞等， 2004） ； 昆虫取食和喷施 都能诱导多酚氧化酶 性明显升高， 而且，越幼嫩的叶片 活性越强。 在自由取食实验中，昆虫 也是 竭力远离最幼嫩的叶片 （ ，2000）。目前认为 抗性机制至少有如下三种（ ， 1998）： (1) 醌本身是 有毒的， (2) 酚的氧化过程中产生的自由基也是直接有毒的， (3) 醌与蛋白形成了不可逆转的复合体，降低了叶片的营养价值，使叶片不再适合于昆虫取食。 杨酸 (导的信号传导途径 目前为数不多的研究表明，昆虫取食方式的不同，诱发的防御反应的类型也不同。 导的类十八烷途径对植物抵御咀嚼式昆虫危害非常重要， 例如， 甜菜夜蛾或棉铃虫取食强烈诱导 活性 （ ， 2000） 。 此外， 咀嚼式昆虫 不仅 咬食植物 组织，而且它们的唾液分泌物能够在取食位点直接产生几丁质或多聚糖， 几丁质 和多聚糖都可作为类十八烷途径的诱导因子。同时，这种取食危害能导致植株的营养成分发生改变， 最终 使 昆虫生长率和存活率下降（ 2001）。咀嚼式昆虫引起的是植物组织 的大面积 损伤，而刺吸式昆虫只造成局部的组织损伤。通常，后者诱导与病原物侵染相似的 径亦即类苯丙烷信号途径，如蚜虫和白粉虱（ 2001）。已有证据支持植物将某些昆虫取食看成是病原物侵染这一观点： 白是病原菌侵染的标志， 而 蚜虫 正 是潜在的 白而非 诱导者；椰粉虱和蚜虫能诱导寄主植物 3葡聚糖酶和几丁质酶的 活性升高，并且 （ 1997）已从大豆中分离出来 一个 70 3 葡聚糖酶激发子绑定蛋白；更为重要的是，目前已经确认了一类与抗蚜虫、抗线虫相关的 R 基因。许多 R 基因能抗一个或少数几种蚜虫的生物型，例如莴苣中的 因能够抗单一的蚜虫生物型 ， 1993） ;苹果中的 导对蚜虫 ， 1997）。 苯丙氨酸解氨酶（ 类苯丙烷途径的第一个关键酶也是限速酶（ 薛应龙 等， 1998），它催化苯丙氨酸生成肉桂酸，而肉桂酸即为 物合成的原料。许多实验都表明了 重要作用，如 因沉默的烟草降低了类苯丙烷的生物合成 能力 ，削弱了对烟草花叶病毒（ 系统获得性抗性（ ， 1999）； 而过量表达 增强植物的 ， 2000）。 遗憾 的是 ， 物合成的其它调控酶 还没有被分离 确定，使用 成缺失的突变体成为研究这些酶的有效手段。 关于 作用机制，大多数学者认为存在 合蛋白， 合蛋白很可能就是 防御 基因转录的调控蛋白（ ， 2001）。 莉酸和水杨酸 在诱导防御中的作用 植物诱导防御反应的重要信号分子，在代谢调控、防御反应、信号交互 作用 等方面发挥着重要的作用。 烟草天蛾 虫取食后， 烟草 内源 平与对照相比升高了 9倍，与伤诱导相比升高了 3 倍（ ， 2001）。在田间，应用 施西红柿植株能够使甜菜夜蛾的被寄生率增加 2 倍（ ， 1999）。 物合成缺失的突变体 其诱导抗性被阻断， 变得更 易受害虫的攻击（ ， 1997）：番茄 成缺失的突变体 虫害反应中不能积累 受害虫的咬食。一个仅含有非常微量的 平的拟南芥突变体，在害虫中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 攻击后即死亡，然而当向植株施加外源 ，这种突变体就可生存。 外源施用 但能强烈诱导抗性蛋白的积累 ,同时可诱导害虫天敌数量的增加。 （ 2003）发现 经过 处理的植株在叶螨危害后对其天敌 吸引作用加强。 （ 2001）证明 用 理过的棉花能够诱 导挥发物的系统释放； 这些研究结果都表明了 植物诱导抗虫性中的巨大应用价值。 除茉莉酸外，水杨酸也可以作为信号分子而介导植物的诱导防御反应。抗性小麦在麦双尾蚜食后 量增加（ ， 2002），意味着 能在小麦的抗蚜机制中发挥作用；水杨酸 甲酯 溶液处理植物后可以诱导酸性几丁质酶基因和病程相关蛋白基因的表达。 号途径 之间的 交互 通讯 (越来越多的研究 表明， 赖性的防御途径中的元件能够相互影响其 它 的途径， 并且大多数的研究表明了 间的拮抗作用。例如，经过丙甲菌素（ 理后的利马豆叶片导致了 逐渐积累，而 积累却阻碍了 13 12生物转化，因此也就降低了 生物合成速度，并最终抑制了所有与 关的挥发物的合成（ ， 2001）；相反地，如果提高 12水平则会引起利马豆某些挥发物的释放（ ， 1999）；这就是说，虫害诱导的挥发物的组分受 导的信号途径之间的相互调控（ ， 2001）。此外， 其 类似物 够抑制 赖 型 的防御基因的表达（ ， 1999），而这种抑制作用 可能是通过抑制 生物 合成 及 活性 来实现的（ ， 1998）。因此， 刘新等（ 2000） 认为 少可在两个位点阻止 合成及其信号的传导：一个位点是由 13 12转化，另一个位点是在 成后到 因转录被激活之前。 然而， 号传导途径抑制作用不太常见，并且 号途径抑制远远弱于 号途径的抑制（ ， 2002）。 然而 ， 间也并不总是拮抗的，尤其是在病原菌与昆虫互作方面，例如： 蓟马和蚜虫取食能够诱导西瓜抗病原真菌 (， 1997)； 类似地， 昆虫 取食能够增加西红柿对蚜虫和病原细菌的抗性 (， 1998a)， 而病原菌侵染西红柿也能够诱导与昆虫取食和伤诱导相关的产生 (， 2001)。 病原细菌侵染后的叶片导致昆虫幼虫的生长速度和存活力下降（ ， 2002） 。 上述这些研究都表明了 径间的协调作用。 毫无疑问， 虫害诱导的植物防御反应中最重要的信 号分子之一，但是，单纯的 形成并不能解释昆虫危害给植物带来的所有改变。例如，尽管过 量 表达 因的转基因马铃薯的 平要比非转基因植株高 6，但是它并不能持续表达 白（ ， 1995）， 这就意味着 不总是在信号传导中发挥作用，而必定存在其他发挥作用的物质。乙烯 是这样的物质之一。它同样能够诱导防御基因的表达。 西红柿的创伤反应中，乙烯和茉莉酸对于蛋白酶抑制剂基因的诱导都是必须的。 乙烯抑制剂阻断了虫害诱导的 因表达，这种抑制作用可被过量的乙烯逆转。在部分丧失乙烯敏感性的番茄 突变体 R)中， 因 的转录 积累被延迟。这些研究都表明乙烯 是 因表达所必需的。 者之间 具有相互协调 作用：O996)等证实外源茉莉酸诱导乙烯产生，并且在乙烯抑制剂存在下，施加茉莉酸对 第一章 引言 5 基因表达无效；将玉米和利马豆用乙烯的前体处理后能够增加 导的挥发物的释放；如果将乙烯的前体同时应用于利马豆叶片则会比单独应用 能增加其对害虫捕食性天敌的吸引力 (， 2001)；在烟草中 观察到了乙烯与 诱导编码 白和渗透蛋白基因 过程中的协同作用 (， 2000)；在拟南芥和西红柿中，乙烯可以正向调控 因的表达（ 1998）。 虫取食诱导的挥发物的生物合成 一般而言，正常健康植株的挥发物代谢均维持在基底水平上，这些挥发物 贮 存在特化的腺体或毛簇（ 。机械损伤和昆虫取食均会诱导植物主动合成并释放一些新的挥发物组分。挥发物的成分因植食性昆虫的种类、取食方式、危害程度及发育阶段；植物的种类、基因型发育阶段、受害部位和受害程度；以及环境压力如光照、季节、水分等不同而异（ ， 1999）。挥发物释放的时间也不尽相同，一些挥发物在受害后 (1 小时内 )立即释放，另一些挥发物则是从头合成的，受害 5、 6 小时后才出现（ W 等， 1998）。挥发物 的 合成途径和结构更是多种多样。最常见的挥发物包括环状的和非环状的萜类化合物（异戊二烯途径）； 赖的途径）挥发物，即绿叶气体； 吲哚（莽草酸 / 色氨酸途径）。 类化合物 虫害诱导的萜类化合物大多是单萜、 双萜、 倍半萜及其衍生物，主要由 类来源于异戊二烯途径，以法尼基二磷酸 (香叶基二磷酸 (底物，由萜合酶(族和其它酶的共同催化而合成， 因的转录水平调控 了 萜类物质的合成。萜类物质的释放还受到其它因素的影响，如昼夜节律，白天释放的挥发物量多，夜间释放的挥发物量少（ ， 2004）。利马豆叶片 受叶螨感染后 释放的萜类化合物能够作为气态的信号分子激活导的防御反应途径（ ， 2000）。无论是挥发性萜还是非挥发性萜都能介导植物体内、植物体间的信号传导（ ， 2005）。 此外，类十八烷途径的中间物能诱导利马豆产生不同类型的萜类挥发物（ ， 1999）。12有激发 物合成的能力， 双萜类化合物来源的。而 主要激活单萜和倍半萜，但是缺乏双萜生物合成的能力。 6 挥发物 来源于脂氧合途径的 发物 (绿叶气体 )是昆虫诱导的挥发物中最 重要 的组分之一 ，包括己烯醇、己烯醛和己烯乙酸。在健康植株中 发物只是低水平释放，但在昆虫取食后就会被迅速合成。合成过程如下：以亚麻酸和亚油酸为底物，在脂氧合酶 (过氧化物水解酶 (13乙酰脱氢酶 (异构因子 (酰基转移酶的催化下，依次生成 发物顺 烷和顺 十八烷途径的 13(s)亚麻酸既可以在作用下生成 12可以在 作用下生成 发物和愈伤素 (一种能刺激伤口愈合的脂 )（ ， 1987）。在某些植物中，亚麻酸和上述关键酶都是经过诱导后从中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 6 头 合成的。 发物既可以作为直接防御物质，也可以作为激活反应的信号， 如在拟南芥中， (E)、 (Z)(Z)2， 62,4,6因的转录（ 2005）。 （ 2000） 认为 发物可在多个水平上影响植物 发物刺激防御基因的表达，降低蚜虫、叶螨的生殖力及 蠋 的取食能力；在一定浓度下 有抗菌活性； 发物能吸引天敌。 但是， 发物也不总是对植物有利，有时对植物自身也是有毒的，如 (E)生长 和 苹果花粉的萌发。 吲哚 来源于莽草酸 /色氨 酸途径的 昆虫诱导产生的另一种挥发物。蚜虫、叶螨取食后都能诱导多种植物释放 ， 1998； ， 2001）。 能有两个作用：其一，与 样，激活 赖的防御信号途径，诱导 因表达和系统获得性抗性 ( ， 1997）。其二， 可能在植株个体的信息交流中发挥作用 (， 1999)。此外， 是强烈的蚜虫 驱 避剂（ ， 1998）。 在昆虫取食诱导的挥发物 测定中，有时也会存在微量的吲哚 。在 玉米中已经了解到了吲哚 是此酶催化了磷酸甘油转变成游离的吲哚（ ， 2000）。 发物的生态学功能 许多植物在遭受昆虫取食后，可以通过 调节第三营养阶层 (天敌 )而间接地防御昆虫。包括为天敌提供食物 (如花粉或花蜜 )、栖息场所、释放挥发物吸引天敌等 (刘芳等， 2003)。 健康植株 和受害 植株释放的不同 挥发物可以成为昆虫鉴别寄主的依据。二斑叶螨 导产生的 (3E， 7E)8， 121,3,7,11 G 等，2004）。二化螟和稻纵卷叶螟幼虫诱导的水稻挥发物对螟蛉绒茧蜂雌蜂有显著的引诱作用（陈华才等， 2003）。菜蚜茧蜂对正常小麦和甘蓝叶片的气味没