【毕业学位论文】四个肠杆菌植酸酶基因的克隆、表达及性质研究博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 四个肠杆菌植酸酶基因的克隆、表达 及性质研究 士研究生：谷维娜 指导教师：姚 斌 研究员 申请学位类别：理学博士 专 业：生物化学与分子生物学 研 究 方 向：酶的分子生物学 培 养 单 位：研究生院 饲料研究所 提交日期 2007 年6 月 007 国农业 学中科院 博士 学 位 论评阅 辩员会单文 人、答 委 名 表 论文题目 四个肠杆菌植酸酶基因的克隆、表达及性质研究 论文作者 谷维娜 专 业 生物化学与分子生物学 研究方向 酶的分子生物学 指导教师 姚斌 培养单位 （研究所、 中心） 中国农业科学院研究生院饲料研究所 姓名 职称 硕（博）单 位 专 业 签 名 莫湘筠 教授级高工 硕导 博导 中国食品发酵工业研究院 酶工程 王璋 教授级高工 硕导 博导 中国食品发酵工业研究院 微生物工程 评 阅 人 张杰 研究员 硕导 博导 中国农业科学院植物保护研究所 微生物学 答辩 主席 宋未 教授 硕导 博导 首都师范大学生命科学院 分子生物学 莫湘筠 教授级高工 硕导 博导 中国食品发酵工业研究院 酶工程 刑建民 研究员 硕导 博导 中国科学院过程工程研究所 微生物学 姜瑞波 研究员 硕导 博导 中国农业科学院农业资源与区划研究所 微生物学 伍宁丰 研究员 硕导 博导 中国农业科学院生物技术研究所 微生物学 叶兴国 研究员 硕导 博导 中国农业科学院作物科学研究所 分子生物学 答 辩 委 员 朱昌雄 研究员 硕导 博导 中国农科院农业环境与可持续发展研究所 微生物学 会议记录（秘书） 杨培龙 论文答辩时间地点 饲料所会议室 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 要 植酸酶（肌醇六磷酸酶）是能够将植酸分解为肌醇和无机磷的一类酶的总称，在饲料工业上的应用可以提高单胃动物对饲料中磷的利用率，降低植酸磷对环境的污染，并降低饲料成本。此外植酸酶还可应用于医药、食品工业。微生物是植酸酶的主要来源，从微生物中筛选新的、性质优良酶蛋白是植酸酶研究的一个重要方向。 本研究根据 植酸酶的保守序列设计简并引物，从肠杆菌科微生物 125、187、 188 菌中扩增出植酸酶基因片段，利用 方法得到了这三个基因的完整序列，分别命名为 外根据鼠疫耶尔森菌（ 基因组测序结果设计引物，通过 隆得到另外一个植酸酶基因 隆的四个植酸酶基因之间的核苷酸一致性最高为 75%（ ，最低为 48%（ 。 通过序列比对分析， 码蛋白与变形肥杆菌（ 源的植酸酶氨基酸序列一致性为 95%，虽然二者一致性较高，但它们在最适温度和热稳定性方面有较大的差异。 码蛋白与软腐欧文氏菌（ 一个假定的磷酸酶蛋白氨基酸序列一致性分别达到 53%和 52%，与肺炎克雷伯菌（ 源的植酸酶氨基酸序列一致性分别为 50%和 49%。说明克隆得到的 两个新的植酸酶基因。 码蛋白与中间型耶尔森氏菌（ 源的植酸酶氨基酸序列一致性为 81%，二者在性质上有所差异。 因均在大肠杆菌中得到表达， 因在酵母中得到表达，表达的植酸酶具有生物学活性。纯化四个酶并对酶学性质进行分析。 适 为 适温度为 60， 定性好，从 余酶活均在 80%以上，比活性为 U/， 38 IU/ 适温度均为 55。 都具有较好的 定性， 从 0%，其中从 余酶活性在 100%。二者的最适 有所区别， 比活性为 U/U/ ， 33 IU/， 66 IU/ 有较高的比活性，达到 U/本研究四个酶中最高的。酶的最适 在酸性条件下活性较高，在 仍有 80%的活性。这在细菌来源的植酸酶中不多见。最适温度为 55。酶的 定性很好，从 余酶活维持在 80%以上。， U/ 据我们所知，目前尚无关于 中发现植酸酶及其相关基因的报道，本研究得到的四个植酸酶为植酸酶家族增添了新的成员。 关键词： 植酸酶，基因克隆，肠杆菌科， to As a of of in to in in as is an of of is an A of FI I) of of of CR of 125, 187 188. of by 125188A by 1of 5% 188 of 8% (1251 In of 1255% to 1871883% 2% to a 18718811% to 125188 pH 125.5 0 . 0% in of 125U/m 125 38 IU/1875 0% of in 187U/m 187 33 IU/ 188pH an 5 . 0% of in he 188U/m 188 66 IU/1at 5 . pH 0% in of U/m 1 U/ To is or 录 第一章 引言 . 1 酸酶的研究进展 . 1 酸酶的来源 . 植酸酶的性质 . 植酸酶的分类 . 植酸酶的研究方向 . 植酸酶的应用 .术 . 12 究目的意义 . 12 第二章 植酸酶基因的克隆 .验材料 . 13 株与质粒 . 13 物合成 . 13 具酶、生化试剂及主要仪器 . 13 养基和有关试剂、溶液配制 . 13 验方法 . 13 . 125、 D. 187、 D. 188 基因组 提取 . 13 酸酶基因部分序列的克隆 . 14 段的回收和连接 . 14 受态细胞的制备 . 15 击转化 . 15 组子筛选 . 16 序 . 16 酸酶基因片段的相似性分析 . 16 . 125 植酸酶基因完整序列的克隆及全基因序列分析 . 16 . 187 与 D. 188 植酸酶基因完整序列的克隆及全基因序列分析 . 17 . 源植酸酶基因的克隆 . 20 果与分析 . 21 酸酶基因部分片段的克隆 . 21 . 125 植酸酶基因完整序列的克隆及全基因序列分析 . 21 . 187 植酸酶基因完整序列的克隆及全基因序列分析 . 24 . 188 植酸酶基因完整序列的克隆及全基因序列分析 . 28 . 源植酸酶基因完整序列的克隆及全基因序列分析 . 31 章小结 . 33 第三章 植酸酶基因的表达及重组蛋白的纯化 .验材料 . 35 株与质粒 . 35 物合成 . 35 剂盒、工具酶和生化试剂 . 35 要仪器 . 35 养基配制 . 35 验方法 . 36 核表达载体 +)构建 . 36 核表达载体 +)构建 . 36 核表达载体 )构建 . 37 )大肠杆菌中的表达及检测 . 38 肠杆菌表达的重组植酸酶 化 . 38 核表达载体 构建 . 39 毕赤酵母中的表达及检测 . 40 赤酵母表达重组植酸酶 纯化 . 41 果与分析 . 42 ) )达载体的构建 . 42 肠杆菌中的表达 . 44 组植酸酶 化 . 45 选具有植酸酶活性的转化子 . 重组植酸酶 纯化 . 49 章小结 . 50 第四章 重组植酸酶酶学性质分析 .验材料 . 51 剂及主要仪器 . 51 关试剂和溶液配制 . 51 验方法 . 51 适 定性 . 51 适反应温度及热稳定性 . 51 活性的测定 . 51 同化学试剂及金属离子对酶活性的影响 . 52 应初速度的测定 . 52 m 值及 测定 . 52 果与分析 . 52 125性质分析 . 52 187性质分析 . 56 188性质分析 . 59 1性质分析 . 62 章小结 . 65 第五章 讨论 .酸酶基因克隆及分析 . 66 计简并引物获得植酸酶基因部分片段 . 66 酸酶基因全长克隆及分析 . 66 酸酶酶学性质分析 . 68 第六章 结论 .考文献 .谢 .者简历 .国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 1第一章 引言 酸酶的研究进展 植酸（ 称六磷酸肌醇（ 一般与钙、镁、钾、钠、铁等金属离子结合，以复合盐类（与若干金属离子）或单盐（与一个金属离子）形式存在，称为植酸盐。植酸盐广泛存在于植物组织中，是植物中磷的基本储存形式，谷物、豆类和油料等作物中的磷 40% 以植酸的形式存在的（ et 1982）。磷是动物生长、繁殖及代谢所必需的矿物质因素之一。单胃动物体内缺少能分解植酸的酶，因而难以有效利用以植酸磷形式存在的磷 , 典型猪日粮中磷利用率只有 15% , 其余 85%左右的磷从粪便中排出（王红宁等， 1998）。为了满足动物正常的生长、代谢需要，必须在动物的饲料中添加无机磷，这样造成许多问题：（ 1）磷资源的浪费。（ 2）高磷粪便对环境的污染。（ 3）植酸磷是一种抗营养因子，它在动物胃肠道的消化过程中会与多种金属离子（如 ）以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物， 降低了动物对这些营养物质的有效利用 （ et 1968; et 1982；姚斌等， 2000）。 植酸酶（ 称肌醇六磷酸酶（ 能够将植酸分解为肌醇和无机磷的一类酶的总称。大量研究表明 , 在猪、禽日粮中添加植酸酶 , 可使饲料中磷的利用率提高 40% 粪便中磷的排出量减少 30%武素平， 1996）。因此在饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。 饲用植酸酶在饲料中得到广泛的推广和应用，其效果已得到确证（ 1993; et 1996）。 图 1酸酶反应通式 1of 植酸酶的来源 物来源的植酸酶 动物来源植酸酶主要存在于哺乳动物的小肠及脊椎动物的红血球和血浆中（ et 1983； et 1985） 。动物植酸酶含量低且活性低很难进行分离纯化和性质测定，因此人们中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 2对动物植酸酶的研究非常少。有学者认为哺乳动物小肠的植酸酶与碱性磷酸酶相同，但人们对其结构仍然了解很少。 物来源的植酸酶 早在 1907 年 （ et 1978）就在米糠中发现了具有植酸酶活性的磷酸酶。研究发现它虽然具有植酸酶活性， 但植酸并不是它的特异性底物。 据报道， 小麦 （ et 1962） 、大豆（ et 1987） 、玉米（ et 1993） 、大麦（ et 2000）以及番茄（ Li et 1997） 、百合（ et 1986）等多种植物都能产植酸酶，但只有少数的植物植酸酶被分离纯化并进行了详细的性质研究。 生物来源的植酸酶 许多微生物都能产植酸酶。从 1968 年起，人们陆续从细菌、真菌及酵母等几十种微生物中分离得到植酸酶（表 1。 很多种细菌如：大肠杆菌（ 、芽孢杆菌（ 、瘤胃微生物、假单孢菌（ 、乳杆菌（ 、克雷伯氏菌（ 都能产植酸酶（ et 2000） 。其中研究较多且有较好应用前景的是来源于 E. 1990; et 1993） 、枯草芽孢杆菌 （ et 1982; et 1998） 和瘤胃微生物的植酸酶 （ et 1998） 。 很多真菌都产植酸酶，第一个被分离纯化的植酸酶来源于土曲霉 et 1968），它的最适 适反应温度为 70C，此酶在 70年代，第二个植酸酶从无花果曲霉（ 纯化出来 (et 1974)。近年来，已有多种真菌来源植酸酶被纯化，并克隆到相关编码基因。如：烟曲霉（ (et 1997)、碳黑曲霉（ 肉色曲霉（ 木霉（ (et 2000)、隔孢伏革菌 ( 2000）、嗜热毁丝霉（ (et 1999)等。 在 1992 年， 发现许旺酵母 （ 能分泌产生植酸酶 （ et 1992） 。此后陆续发现了三十多种产植酸酶的酵母（ et 1999; et 2000） 。但在微生物植酸酶中人们对酵母植酸酶的研究较少。 酸酶的性质 植物来源植酸酶分子量变化较大，较小的有米糠植酸酶为 47 et 1962），较大有绿豆植酸酶达 160 et 1972）。酶的最适 ，接近中性。最适反应温度在 35 围内 （表 1 微生物来源部分植酸酶生化性质参见表 1菌来源的植酸酶分子