硕士研究生毕业论文三七药材及提取物农药残留测定分析.doc

XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 1 硕士研究生毕业论文 三七药材及提取物三七药材及提取物 农药残留测定分析农药残留测定分析 XXXX 年 XX 月 XX 日 XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 2 中文摘要中文摘要 三七是我国的名贵中药，为了有效地监测其农药残留情况，控制其内在质 量，满足国际市场的要求，本论文建立了三七药材及其提取物和制剂的农药残 留分析方法，并制定相应的限度标准，同时为其他中药建立通用的农药残留分 析方法与严格完善的农药残留限量标准提供科学依据与方法借鉴，提高中药品 质，增强中药在国际市场上的竞争力，使中药早日全面进入国际市场。 本论文结合国内外文献，运用气相色谱-质谱联用技术，建立了三七药材、 三七药材提取物三七三醇皂苷及三七通舒胶囊中四大类 20 种农药同时测定的定 性定量分析方法。首先对色谱柱、进样口温度、特征离子、离子源温度等进行 优选研究，确定了色谱、质谱条件，然后再通过对样品提取溶剂、提取方法和 净化方法的实验研究，确定了三七药材、三七三醇皂苷原料药及三七通舒胶囊 的样品前处理方法，之后对建立的方法进行方法学验证，最后运用建立的分析 方法分别对 15 个批次的三七药材、15 个批次的三七三醇皂苷原料药及 15 个批 次的三七通舒胶囊进行 20 种农药残留量的检测。 结果表明，实验所建立的 20 种农药残留测定的分析方法准确灵敏、稳定可 靠，重复性、专属性和耐用性均很好，可控性强。15 批 PTS 和 15 批三七通舒 胶囊均未检出 20 种农药，而三七药材中农药残留现象较为普遍，15 批药材有 不同程度的农药残留检出。 关键词：关键词：三七药材；三七三醇皂苷；三七通舒胶囊；农药残留；气相色谱- 质谱联用；固相萃取。 XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 3 ABSTRACTABSTRACT Panax Notoginseng is a very valuable medicine in China.To monitor its pesticide residues effectively,control its inner quality,meet the requirements of international markets,this thesis established methods of analysis for pesticide residues in Panax Notoginseng,its extract and its herbal preparation,and made limit standards.At the same time,it provided scientific basis and mothods reference for the establishment of universal methods of analysis for pesticide residues and strict,complete limit standards in other Chinese materia medica,improved the quality of Chinese materia medica,enhanced the competitiveness of Chinese materia medica in the international markets and made Chinese materia medica fully enter international markets as soon as possile. This thesis incorporated the literatures at home and abroad, made use of gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS),to develop methods of qualitative and quantitative analysis simultaneously for 20 pesticide residues in Panax Notoginseng, its extract PTS and SanQiTongShu Capsules.First,we studied and optimized the chromatographic columns,injection temperature,characteristic ions,ion source temper- ature during the experiment,built the GC and MS condition.Then we studied the extra- ction solvents, extraction methods and purification methods of sample and built the pre-processing methods of Panax Notoginseng,PTS raw materials and SanQiTongShu Capsules.Then we studied method validation.Finally,we used the analytical methods built up to detect 20 pesticide residues in 15 batches of Panax Notoginseng, 15 batch- es of PTS and 15 batches of SanQiTongShu Capsules. The results showed that the analytical methods built up to determine 20 pesticide residues were accurate,stable and reliable,which had a high sensitivity,good repeatability,good specificity,good durability and good controllability.None of 20 pes- ticides were detected in 15 batches of PTS and 15 batches of SanQiTongShu Capsules .But the phenomenon of pesticide residues in Panax Notoginseng was common,and different levels of pesticide residues were detected in 15 batches of Panax Notogin- seng. Keywords:Keywords:Panax Notoginseng; Protopanaxatriol Saponin(PTS); SanQi TongShu Capsule;pesticide residues;gas chromatography-mass spectrometry;solid phase extrac- tion(SPE). XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 4 目目 录录 中文摘中文摘要要 .1 1 ABSTABSTR RACTACT .2 2 目目 录录 .3 3 缩略词英缩略词英汉汉对照对照 .5 5 1.1.引引言言 .6 6 1.1 国内外研究现状 .6 1.2 项目研究的意义与创新点 .7 2.2.正正文文 .8 8 2.1 实验仪器与材料 .8 2.1.1 仪器与设备 .8 2.1.2 标准品 .8 2.1.3 试药 .9 2.1.4 试剂 .10 2.2 实验方法与结果 .10 2.2.1 标准品溶液和内标溶液的制备 .10 2.2.1.1 标准品储备溶液的制备 .10 2.2.1.2 混合标准品溶液的制备 .11 2.2.1.3 内标储备溶液的制备 .12 2.2.1.4 内标工作溶液的制备 .12 2.2.2 色谱、质谱条件 .13 2.2.3 供试品溶液的制备 .13 2.2.3.1 三七药材供试品溶液的制备 .13 2.2.3.2 三七三醇皂苷原料药供试品溶液的制备 .14 2.2.3.3 三七通舒胶囊供试品溶液的制备 .14 2.2.4 实验方法的优化研究 .15 2.2.4.1 色谱条件的选择 .15 2.2.4.2 质谱条件的选择 .15 2.2.4.3 样品前处理方法的选择 .17 2.2.5 方法学研究 .19 2.2.5.1 系统适应性试验 .19 XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 5 2.2.5.2 检测限和定量限 .19 2.2.5.3 线性范围考察 .21 2.2.5.4 回收率试验 .26 2.2.5.5 重复性试验 .29 2.2.5.6 精密度试验 .30 2.2.5.7 专属性试验 .33 2.2.5.8 耐用性试验 .35 2.2.6 农药残留量测定 .36 2.2.6.1 定性测定 .36 2.2.6.2 定量测定 .36 2.2.6.3 样品测定 .36 2.3 结论 .38 2.4 讨论 .39 2.4.1 三七药材、PTS 及三七通舒胶囊 20 种农药残留量限量标准的制定 .39 2.4.2 基质效应的影响 .40 2.4.3 中药农残残留研究中存在的问题 .41 2.4.4 展望 .41 3.3.总总结结 .4343 致致 谢谢 .4444 参考文献参考文献 .4545 附附 图图 .4848 综综 述述 .4949 后置部分后置部分 .6161 XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 6 缩略词英汉对照缩略词英汉对照 缩略词缩略词英文名称英文名称中文名称中文名称 EIEIElectronElectron IonisationIonisation 电子电离电子电离 GCGCGasGas ChromatographyChromatography 气相色谱气相色谱 GPCGPCGelGel PermeationPermeation ChromatographyChromatography 凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱 LODLODLimitLimit OfOf DetectionDetection 检测限检测限 LOQLOQLimitLimit OfOf QuantitationQuantitation 定量限定量限 MRLMRLMaximumMaximum ResidueResidue LimitLimit 最大残留限量最大残留限量 MSMSMassMass SpectrometrySpectrometry 质谱质谱 NDNDNoNo DetectedDetected 未检出未检出 PTSPTSProtoparaxotriolProtoparaxotriol SaponinsSaponins 三七三醇皂苷三七三醇皂苷 RSDRSDRelativeRelative StandardStandard DeviationDeviation 相对标准偏差相对标准偏差 SCANSCANSCANSCAN 全扫描全扫描 SIMSIMSelectedSelected IonIon MonitoringMonitoring 选择离子监测选择离子监测 SPESPESolidSolid PhasePhase ExtractionExtraction 固相萃取固相萃取 SPMESPMESolidSolid PhasePhase MicroextractionMicroextraction 固相微萃取固相微萃取 TICTICTotalTotal IonsIons ChromatographyChromatography 总离子流色谱总离子流色谱 XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 7 1 1引引 言言 上世纪八十年代以来，随着人类健康意识的增强和回归大自然的浪潮高涨， 人们越来越重视中药中农药的残留问题。资料显示，我国的中药材农药污染现 象较为普遍，我国出口的中药在日韩、欧美等国市场上多次因农药残留超标等 原因被查扣返回1，极大地影响了中药的声誉，农药残留问题已成为中药走向 世界的“拦路虎” 。因此，中药农药残留问题是我国中药研究领域亟待解决的关 键问题之一。 1.11.1 国内外研究现状国内外研究现状 上世纪八十年代以来，由于现代分析技术和仪器的飞速发展，我国科学工 作者开始对中药的农药残留检测进行研究。但到目前为止，我国中药农药残留 分析研究中绝大多数仍然采用传统气相色谱法或液相色谱法配备不同的检测器 进行检测，很少采用先进的各种色谱-质谱联用技术。而且研究多集中在单一中 药品种中的某一类农药如有机氯类的分析方法研究，尚未出现中药中农药残留 全成分研究的报道。近年来，也出现了少量运用固相萃取法（SPE） 、色谱-质谱 联用技术检测中药中农药残留的报道2,3,4,5,6,7,8，但都是仅限于实验室研究，尚 未大范围应用。此外，我国的中药农药残留限量标准不仅数量少，覆盖农药品 种少。 中国药典2005 版一部9中对于农药残留量的测定只规定了 9 种有机氯 类农药、12 种有机磷类农药和 3 种拟除虫菊酯类农药三类农药的 3 种测定方法， 覆盖农药品种少，而且分析方法均为单一的气相色谱法，对中药提取物和中药 制剂中的农药残留均未进行限制。我国现在执行的涉及中药农药残留限量的标 准有中国药典2005 年版中规定的甘草、黄芪标准；香港中药材标准（第一 册） ；国家药用植物及制剂外经贸绿色行业标准 （WM/T2-2004） ；国家标准人 参（GB/T 155l7.1 及 GB/T l8335） ；国家标准甘草（GB/T l9618-2004） ；国家 标准枸杞（GB/T 18672-2002） ；国家标准三七（GB 19086-2003） ；北京市中 药炮制规范中人参、枸杞饮片1。但以上标准都只检测相关药材中六六六、 滴滴涕等少数几种有机氯类农药。 在国外，欧美、日韩等发达国家多采用先进成熟的分析检测技术进行植物 XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 8 药农药残留监测工作，如固相萃取法（SPE） 、固相微萃取技术(SPME)、气相色 谱与质谱联用技术、液相色谱与质谱联用技术、超临界流体色谱技术、毛细管 电泳技术等10,11,12,13,14,15，这些技术的应用大大提高了农药残留检测的灵敏度、 定性、定量能力，扩大了检测农药的覆盖范围，目前国外已发展出可以同时检 测上百种农药的多残留分析系统，如美国 FDA 的多残留检测方法可检测 360 多 种农药，德国 DFG 的方法可检测 325 种农药，加拿大多残留检测方法可检测 251 种农药（其中 GC-MS 检测 239 种）16,17。欧盟除规定了有机氯类农药残留 量外，还规定了有机磷类农药和除虫菊酯类农药的限量，对植物药中农药残留 的限量规定远严于中国。目前，欧盟已经对 133 种农药设定了 17000 个限量， 并通过与美国药典 、 日本药典的协调，使各国药典的检查项和限量标准 达成一致，规定了植物药中 34 种农药的最大残留限量18。 而对于中药提取物和中药制剂的农药残留分析研究，相关的报道非常少。 由于中药提取物和中药制剂在制备过程中，原料中药材经过提取、净化、浓缩、 干燥、制剂成型等复杂的步骤后农药的残留量变得很低，而且中成药制剂、剂 型多样，使得农药的提取、分离、净化与富集难度增大，检测更为复杂。迄今 为止，国内外尚未统一制定出中成药中农药残留量的检测方法和限量标准。 1.21.2 项目研究的意义与创新点项目研究的意义与创新点 查阅近 20 年来关于三七中农药残留检测研究的文献，仅有 6 篇19,20,21,22,23,24， 且多数仅仅对三七药材中的六六六、滴滴涕等少数几种有机氯类农药进行了测 定。本项目研究的目的在于建立三七药材及其提取物和制剂的中药农药多残留 分析方法，并制定相应的限度标准，使中药三七满足国际市场的要求，同时更 重要的是为中药建立先进通用的农药残留分析方法与严格完善的农药残留限量 标准提供科学依据与方法借鉴，提高中药品质，树立中药在国际市场上的良好 声誉，增强中药在国际市场上的竞争力，使中药早日全面进入国际市场。 本研究的创新点在于：首次运用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对三七 药材、药材提取物及其制剂进行检测分析；首次运用先进成熟的固相萃取法 （SPE）对三七药材、药材提取物及其制剂样品进行前处理。 XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 9 2.2.正正 文文 2.12.1 实验仪器与材料实验仪器与材料 2.1.12.1.1 仪器与设备仪器与设备 Agilent 7890A 气相色谱仪（安捷伦科技公司） ， Agilent 5975C 质谱仪（安捷伦科技公司） ， Sartorius BP211D 十万分之一分析天平（德国赛多利斯公司） ， METTLER AE240 万分之一分析天平（瑞士梅特勒公司） ， Waters 固相萃取仪（美国沃特世公司） ， Caliper TurboVap LV 全自动氮吹仪（美国 Caliper Life Sciences 公司） ， IKA MS3 数码涡旋振荡仪（广州仪科实验室技术公司） ， HY-2A 往复振荡器（江苏常州澳华仪器公司） ， Auto Science AS5150A 超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）, Gilson Pipetman P20、P100、P200、P1000 移液器（法国吉尔森公司） ， Agela ODS C18 固相萃取柱（天津艾杰尔博纳公司） ， Agela Florisil 固相萃取柱（天津艾杰尔博纳公司） ， Agela PestiCarb/NH2 固相萃取柱（天津艾杰尔博纳公司） 。 2.1.22.1.2 标准品标准品 20 种农药标准品和内标标准品的名称、分子量、分类、含量及生产厂家见 表 1。 XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 10 表表 1 1 2020 种农药标准品和内标标准品的名称、分子量、分类、含量及厂家种农药标准品和内标标准品的名称、分子量、分类、含量及厂家 编号中文名称英文名称分子量分类 含量 （%） 生产厂家 01 -六六六 Alpha-HCH290.82 有机氯类 97.5 德国 GmbH 公司 02 -六六六 Beta-HCH290.82 有机氯类 98.4 德国 GmbH 公司 03 -六六六 Gamma-HCH290.82 有机氯类 98.5 德国 GmbH 公司 04 五氯硝基苯 Quintozene295.33 有机氯类 97.0 德国 GmbH 公司 05 百菌清 Chlorothalonil265.91 有机氯类 97.5 德国 GmbH 公司 06 七氯 Heptachlor373.32 有机氯类 98.7 德国 GmbH 公司 07 甲基五氯 苯基硫醚 Methyl-pentachlorophenyl sulfide 296.43 有机氯类 99.0 德国 GmbH 公司 08 毒死蜱 Chlorpyrifos350.59 有机磷类 99.0 德国 GmbH 公司 09 艾氏剂 Aldrin364.91 有机氯类 98.5 德国 GmbH 公司 10 腐霉利 Procymidone284.14 杀真菌剂 99.5 德国 GmbH 公司 11 -氯丹 Gamma-Chlordane409.78 有机氯类 99.7 德国 GmbH 公司 12 顺式氯丹 Cis-Chlordane409.78 有机氯类 99.0 德国 GmbH 公司 13 4，4-滴滴伊p，p-DDE 318.02 有机氯类 98.5 德国 GmbH 公司 14 4，4-滴滴滴p，p-DDD 320.04 有机氯类 98.0 德国 GmbH 公司 15 2，4-滴滴涕o，p-DDT 354.49 有机氯类 98.5 德国 GmbH 公司 16 4，4-滴滴涕p，p-DDT 354.49 有机氯类 98.5 德国 GmbH 公司 17 甲氰菊酯 Fenpropathrin349.43 拟除虫菊酯类 99.5 德国 GmbH 公司 18 功夫菊酯 Lambda-cyhalothrin449.90 拟除虫菊酯类 98.5 德国 GmbH 公司 19 -氯氰菊酯 Alpha-Cypermethrin416.33 拟除虫菊酯类 99.5 德国 GmbH 公司 20 顺式氰戊菊酯 Esfenvalerate419.90 拟除虫菊酯类 98.0 德国 GmbH 公司 21 三硫磷（内标） Carbophenothion342.87 有机磷类 99.4 德国 GmbH 公司 2.1.32.1.3 试药试药 三七药材 15 批及空白阴性药材 1 批，三七药材提取物三七三醇皂苷 XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 11 （PTS）原料药 15 批及空白阴性 PTS 1 批、三七通舒胶囊 15 批及空白阴性三七 通舒胶囊 1 批，以上三种试药均由成都华神集团公司制药厂提供。各供试品的 编号及批号见表 2。 表表 2 2 三种试药三种试药 4545 批供试品的编号及其批号批供试品的编号及其批号 编号三七药材批号PTS 批号三七通舒胶囊批号 01060601071204080102 02061101071223080501 03070101080105080607 04070301080416080802 05070401080503080907 06071001080504081105 07071002080505090201 08071003080507090202 09071101080601090203 10071102080606090204 11071103081105090205 12071104081106090206 13071201081201090207 14071202081202090209 15080301081203090210 16 061201（空白）080101（空白）080601（空白） 2.1.42.1.4 试剂试剂 乙腈，正己烷，丙酮，乙酸乙酯，甲苯，无水硫酸钠。除无水硫酸钠为分 析纯外，其余均为色谱纯。高纯氦气（纯度99.999%） （四川梅塞尔气体公司） 。 2.22.2 实验方法与结果实验方法与结果 2.2.12.2.1 标准品溶液和内标溶液的制备标准品溶液和内标溶液的制备 2.2.1.12.2.1.1 标准品储备溶液的制备标准品储备溶液的制备 分别精密称取一定量的 20 种农药标准品，各置于 100ml 容量瓶中，加入乙 酸乙酯适量溶解，再加入乙酸乙酯定容至刻度，摇匀，即得 20 种农药的标准品 XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 12 储备溶液。20 种农药的称样量及单标浓度见表 3。 表表 3 3 2020 种农药标准品的称样量及单标浓度种农药标准品的称样量及单标浓度 农药名称称样量（mg）单标浓度（g/ml） -六六六 10.1198.57 -六六六 11.19110.11 -六六六 11.15109.83 五氯硝基苯 9.6793.80 百菌清 9.7695.16 七氯 12.55123.87 甲基五氯苯基硫醚 10.59104.84 毒死蜱 10.84107.32 艾氏剂 9.2090.62 腐霉利 11.18111.24 -氯丹 9.5294.91 顺式氯丹 3.2131.78 4，4-滴滴伊 10.33101.75 4，4-滴滴滴 10.31101.04 2，4-滴滴涕 9.2591.11 4，4-滴滴涕 9.8597.02 甲氰菊酯 9.8397.81 功夫菊酯 10.92107.56 -氯氰菊酯 12.58125.17 顺式氰戊菊酯 10.33101.23 2.2.1.22.2.1.2 混合标准品溶液的制备混合标准品溶液的制备 精密移取上述 20 种农药标准品储备溶液各一定量置于置于同一 100ml 容量 瓶中，加入乙酸乙酯稀释定容至刻度，摇匀即得。20 种农药的取液量及浓度见 表 4。 XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 13 表表 4 4 2020 种农药的取液量及混标浓度种农药的取液量及混标浓度 农药名称取液量（ml）混标浓度（g/ml） -六六六 1.00.99 -六六六 1.01.10 -六六六 1.01.10 五氯硝基苯 3.02.81 百菌清 1.00.95 七氯 2.02.48 甲基五氯苯基硫醚 1.51.57 毒死蜱 3.03.22 艾氏剂 3.02.72 腐霉利 3.03.34 -氯丹 1.51.42 顺式氯丹 5.01.59 4，4-滴滴伊 1.01.02 4，4-滴滴滴 1.01.01 2，4-滴滴涕 2.01.82 4，4-滴滴涕 2.01.94 甲氰菊酯 4.03.91 功夫菊酯 4.04.30 -氯氰菊酯 5.06.26 顺式氰戊菊酯 5.05.06 2.2.1.32.2.1.3 内标储备溶液的制备内标储备溶液的制备 精密称取三硫磷标准品 15.51mg 置于 100ml 容量瓶中，加入乙酸乙酯适量 溶解，再加入乙酸乙酯定容至刻度，摇匀即得。 2.2.1.42.2.1.4 内标工作溶液的制备内标工作溶液的制备 XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 14 精密移取内标储备液 5ml 置于 50ml 容量瓶中，加入乙酸乙酯定容至刻度， 摇匀即得。 2.2.22.2.2 色谱、质谱条件色谱、质谱条件 色谱条件：色谱条件：色谱柱：HP-1MS 毛细管色谱柱（30m0.32mm1m） ；柱温升 温程：80（保持 1min） ，以 15/min 升至 180，再以 3/min 升至 205 （保持 10min） ，再以 5/min 升至 270（保持 3min） ，最后以 30/min 升至 280（保持 9min） ；载气：高纯氦气，载气速度：1.0ml/min（0-44min） ， 3.0ml/min（44-63min） ；进样方式：脉冲不分流，1.5min 后打开分流阀；进样 口温度：260；进样量：2l。 质谱条件：质谱条件：离子源：电子电离（EI）源；电离能量：70eV；离子源温度： 250；GC-MS 接口温度：280；四级杆温度：180；溶剂延迟：14min；扫 描模式：选择离子监测（SIM） ，1 个定量离子，2-3 个定性离子。所有离子按各 农药保留时间的先后顺序，分时段分别检测。 2.2.32.2.3 供试品溶液的制备供试品溶液的制备 2.2.3.12.2.3.1 三七药材供试品溶液的制备三七药材供试品溶液的制备 提取提取 取供试品粉末（过三号筛）约 2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中， 加入乙腈 20ml，无水硫酸钠 8g，振荡 60min（250r/min） ，滤过，滤液备用；药 渣加入乙腈 10ml，振荡 10min（250r/min） ，滤过，滤液与前滤液合并，置氮吹 仪上 40吹至约 1ml，待净化。 净化净化 将上述提取浓缩液置于 C18 固相萃取柱（1000mg/6ml，加样前柱 上加无水硫酸钠约 1cm 高，用乙腈 5ml 预淋洗）上，容器用乙腈洗涤 3 次，每 次 1ml，洗液置于同一 C18 柱上，再用乙腈 15ml 洗脱，收集洗脱液，置氮吹仪 上 40吹至约 1ml，加少量正己烷替换两次至乙腈除尽，残渣加正己烷 1ml 使 溶解，置于弗罗里硅土（Florisil）固相萃取柱（1000mg/6ml，加样前柱上加 无水硫酸钠约 1cm 高，依次用正己烷-丙酮（9:1）10ml 和正己烷 10ml 预淋洗） 上，容器用正己烷-丙酮（9:1）洗涤 3 次，每次 1ml，洗液置于同一 Florisil 柱上，再用正己烷-丙酮（9:1）15ml 洗脱，收集洗脱液，置氮吹仪上 40吹至 约 1ml，加少量乙腈替换两次至正己烷、丙酮除尽，残渣加乙腈 1ml 使溶解， XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 15 置于石墨化碳/氨基（PestiCarb/NH2）串联固相萃取柱（500mg+500mg/6ml，加 样前柱上加无水硫酸钠约 1cm 高，用乙腈-甲苯（3:1）5ml 预淋洗）上，容器 用乙腈-甲苯（3:1）洗涤 3 次，每次 1ml，洗液置同一 PestiCarb/NH2串联柱上， 再用乙腈-甲苯（3:1）25ml 洗脱，置氮吹仪上 40吹至近干，加入内标工作溶 液 40l、乙酸乙酯 960l 使溶解，涡旋混匀，经 0.2m 滤膜滤过，取续滤液， 即得。 2.2.3.22.2.3.2 三七三醇皂苷原料药供试品溶液的制备三七三醇皂苷原料药供试品溶液的制备 提取提取 取供试品粉末约 2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入乙腈 20ml，无水硫酸钠 8g，振荡 60min（250r/min） ，滤过，滤液备用；药渣加入乙 腈 10ml，振荡 10min（250r/min） ，滤过，滤液与前滤液合并，置氮吹仪上 40 吹至约 1ml，待净化。 净化净化 将上述提取浓缩液置于 C18 固相萃取柱（1000mg/6ml，加样前柱 上加无水硫酸钠约 1cm 高，用乙腈 5ml 预淋洗）上，容器用乙腈洗涤 3 次，每 次 1ml，洗液置于同一 C18 柱上，再用乙腈 15ml 洗脱，收集洗脱液，置氮吹仪 上 40吹至约 1ml，置于石墨化碳/氨基（PestiCarb/NH2）串联固相萃取柱 （500mg+500mg/6ml，加样前柱上加无水硫酸钠约 1cm 高，用乙腈-甲苯 （3:1）5ml 预淋洗）上，容器用乙腈-甲苯（3:1）洗涤 3 次，每次 1ml，洗液 置同一 PestiCarb/NH2串联柱上，再用乙腈-甲苯（3:1）25ml 洗脱，置氮吹仪 上 40吹至近干，加入内标工作溶液 40l、乙酸乙酯 960l 使溶解，涡旋混匀， 经 0.2m 滤膜滤过，取续滤液，即得。 2.2.3.32.2.3.3 三七通舒胶囊供试品溶液的制备三七通舒胶囊供试品溶液的制备 提取提取 取供试品胶囊内容物约 2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入 乙腈 20ml，无水硫酸钠 8g，振荡 60min（250r/min） ，滤过，滤液备用；药渣加 入乙腈 10ml，振荡 10min（250r/min） ，滤过，滤液与前滤液合并，置氮吹仪上 40吹至约 1ml，待净化。 净化净化 将上述提取浓缩液置于 C18 固相萃取柱（1000mg/6ml，加样前柱 上加无水硫酸钠约 1cm 高，用乙腈 5ml 预淋洗）上，容器用乙腈洗涤 3 次，每 次 1ml，洗液置于同一 C18 柱上，再用乙腈 15ml 洗脱，收集洗脱液，置氮吹仪 XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 16 上 40吹至约 1ml，置于石墨化碳/氨基（PestiCarb/NH2）串联固相萃取柱 （500mg+500mg/6ml，加样前柱上加无水硫酸钠约 1cm 高，用乙腈-甲苯 （3:1）5ml 预淋洗）上，容器用乙腈-甲苯（3:1）洗涤 3 次，每次 1ml，洗液 置同一 PestiCarb/NH2串联柱上，再用乙腈-甲苯（3:1）25ml 洗脱，置氮吹仪 上 40吹至近干，加入内标工作溶液 40l、乙酸乙酯 960l 使溶解，涡旋混匀， 经 0.2m 滤膜滤过，取续滤液，即得。 2.2.42.2.4 实验方法的优化研究实验方法的优化研究 2.2.4.12.2.4.1 色谱条件的选择色谱条件的选择 （1 1）色谱柱的优选）色谱柱的优选 对 HP-1MS 毛细管柱（30m0.25mm0.25m） 、HP-1MS 毛细管柱 （30m0.32mm 1m）和 DB-35MS 毛细管柱（30m0.32mm0.25m）进行了试验比较，结果 发现第一柱各农药出峰时间比后两柱短，但是个别定量离子相同的峰不能达到 基线分离；第三柱虽然能够使 20 种农药峰基线分离，然而多数峰形差，部分峰 出现严重的拖尾；只有第二柱虽然各物质出峰时间比第一柱长一些，但是能使 20 中农药全部达到基线分离，而且峰形较好，故实验选择 HP-1MS 毛细管柱 （30m0.32mm1m） 。 （2 2）进样口温度的确定）进样口温度的确定 进样口温度直接影响着目标物的响应值、峰形和峰分离度，是一个很重要 的实验条件。取混合标准品溶液分别于进样口温度 230、240、250、 260、270时进样分析，结果表明：当进洋口温度250时，20 种农药的 响应值变化不大，峰形较好，达到基线分离。由于实验所用的 20 种农药沸点差 异较大，为保证其充分汽化，并考虑到仪器的承受能力和使用寿命，最终实验 选择进样口温度为 260。 2.2.4.22.2.4.2 质谱条件的选择质谱条件的选择 （1 1）特征离子的确定）特征离子的确定 移取内标工作溶液 0.1ml，混合标准品溶液 1.0ml 置于同一 2ml 容量瓶内， XXXX 医药大学 XXXX 年硕士研究生毕业论文 17 加乙酸乙酯定容至刻度，摇匀，进样分析，选择全扫描方式（SCAN）得到 20 种 农药和内标三硫磷的总离子流色谱图（TIC）,提取出每个峰的质谱图，再在化 合物谱库中进行检索，确证每一种农药。然后在每种农药的质谱图中选择三至 四个丰度高、质量数大、干扰小的碎片离子作为相应农药的定性、定量特征监 测离子，其中定量离子 1 个，定性离子 2-3 个，采用选择离子监测（SIM）方式 进行定性和定量分析。20 种农药和内标三硫磷的总离子流色谱图（TIC）见图 1，保留时间、定量离子、定性离子与 SIM 开始时间见表 5。 表表 5 5 2020 种农药和内标三硫磷的保留时间、定量离子、定性离子与种农药和内标三硫磷的保留时间、定量离子、定性离子与 SIMSIM 开始时间开始时间 农药名称 保留时间 (min) 定量离子 (m/z) 定性离子 (m/z) SIM 开始 时间(min) -六六六 15.70181(100)219(96),254(71),111(80)14.50 -六六六 16.22183(92)219(100),254(63),109(73)16.00 -六六六 17.06181(100)219(95),254(77),111(43)16.70 五氯硝基苯 17.58237(100)295(73),214(52),177(35)17.30 百菌清 18.03266(100)264(83),268(23)17.80 七氯 22.32272(100)237(63),337(15)21.50 甲基五氯苯基硫醚 23.95296(100)246(7