【毕业学位论文】蚕品种选育及用微卫星标记（SSR）构建家蚕指纹图谱硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 蚕品种选育及用微卫星标记（ 建家蚕指纹图谱 of 同等学力申请硕士学位 ）研究生: 钱 荷 英 指 导 教 师：徐 安 英 副研究员 申请学位类别：农学硕士 专 业 ：特种经济动物饲养 研 究 方 向：家蚕遗传育种 培 养 单 位：中国农业科学院 研 究生院蚕业研究所 提交日期 2005 年 6 月 of of 2005 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间：2004 年 6 月 6 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 时间：2005 年 6 月 6 日 导师签名： 时间：2005 年 6 月 6 日 论文评阅人和答辩委员会成员名单 论 文 评 阅 人：楼程富 教 授 浙江大学 秦 利 教 授 沈阳农业大学 张国政 研究员 中国农科院蚕业研究所 答辩委员会主席：李奕仁 研究员 中国农科院蚕业研究所 答辩委员会成员：吴大洋 教 授 西南农业大学 何斯美 研究员 中国农科院蚕业研究所 鲁兴萌 教 授 浙江大学 赵巧玲 副研究员 中国农科院蚕业研究所 论文答辩日期：2005 年 6 月 26 日 摘 要 种桑养蚕、缫丝织绸是我国劳动人民的伟大发明，对我国古代传统文明的传播和现代国民经济的发展作出了卓越贡献。而茧丝绸行业的基础是原料茧的生产，其数量多寡，产品优劣，科技含量等左右着丝绸业的兴衰，因此抓丝绸贸易就必须从源头抓起。实践证明培育和推广优良品种是一项投资少、见效快、经济效益高的蚕业增产增收技术手段。 另外由于长期的自然选择和人工选育，家蚕 形成了 4 大地理系统和多种生态类型，有上千个品种。如此丰富的家蚕品种，首先需要确定品种范围，判断品种的归属性，以便更有效地保护，避免重复和遗漏；其次，随着品种种质监测要求的提高和知识产权保护意识的加强，国际上已出现了在审定品种时要附加 纹图谱的趋势。利用微卫星分子标记（，开展家蚕种质资源的指纹图谱、亲缘关系和分子系统发育等研究，对蚕种质的鉴定、保护、利用、核心种质的构建和遗传育种具有重要的实用价值和理论意义。本论文主要研究内容如下。 1. 春秋兼用蚕品种润花镇月的选育 根据江苏浙江等地区主要蚕区春蚕秋养或秋蚕春养的要求，把育种目标确定为培育综合性状较优的强健性稳产型蚕品种。采用杂交育种与系谱选育相结合的方法，选择优良亲本材料，经过 3年十几代的连续选择和改进，育成一对春秋兼用蚕品种润花镇月。该品种经本实验室和两年三地全国攻关点联合鉴定，结果表明：结茧率 95以上，万蚕收茧量、万蚕茧层量、万头产丝量分别比对照种提高 515% 、10 20%、 15 20%，茧层率 1520% ，茧丝长 10001300 米，解舒率 75 88%， 生丝率 1820% ，净度 94 96 分，各项经济技术指标均达到国家考核技术经济指标。该品种体质强健，好养，耐氟，抗高温，孵化、眠起、老熟齐一，丝质优，产茧量高，产卵数多，繁育系数高，适合于长江流域、黄河流域全年饲育。该品种于 2004 年 11 月获得北方蚕业科研协作区蚕品种审定委员会第五次会议审定通过，准予在适宜地区推广使用。 2. 利用微卫星标记（建家蚕品种资源的指纹图谱 选用微卫星分子标记（对中国农科院蚕业研究所蚕种质资源保存中心的 96 个家蚕材料（95 个品种即 2 个中系、 85 个日系二化和 9 个多化）进行 纹图谱的构建，建立一套准确、快速、有效的鉴别家蚕品种的方法。同时把各品种的指纹图谱作为该品种的“分子身份证” ，与其它经济性状，形态性状一起构成各品种的固有性状。 家蚕种质资源进行聚类和亲缘关系分析。 选用 68 对 物对 96 个不同家蚕品种的基因组 行扫描，用 析扫描结果，得到各品种之间的遗传距离。对遗传距离进行聚类分析，构建分子系统树，从中可以看出除个别品种外，所研究的 96 个材料中多数品种均按所属系统聚为相对集中的一群，即中系、日系和热带多化 3 个类群。在各类群里，品种之间又按彼此间亲缘关系的远近相聚，如日系品种的苏字号、镇字号、7 字号和 8 字号品种相对集中在一起。从总的聚类结果看，基本上含有共同亲本或互为亲子关系的，具有相同血缘的蚕品种聚为一类。分子系统树的构建为遗传育种提供有力的工具。 关键词：家蚕 品种选育 微卫星标记 指纹图谱 分子系统树 I he of of of of to of of is of of of If to to do it It its a to It be of of to we to to it to NA in of of of of SR is of of is as 1. a to of or we at We to we in a 1 of of 5%. 0 000 15%, 10 20%, 15 20% 520% is 000 1300 m. of 5 88%, 19 21% is 4 96 of s is to to it is to is of is is It is of of to in of of SR he of 85 of be up of 3. of of NA 6 8 SR is to of is by we of 6 to In to u, or 录 第一章 绪论 1 家蚕品种选配研究的目的与意义 1 国内外品种选育 1 代我国现行蚕品种育成与推广 1 用蚕品种选育 1 秋蚕品种选育 3 秋兼用蚕品种 5 外品种研究进展 6 望 6 蚕分类、鉴定的目的与意义 7 蚕分类、鉴定的研究内容与方法 7 态学方法 7 理学方法 8 物化学方法 8 子标记方法 9 术 9 析 10 析 11 析 12 卫星标记在家蚕中的应用 14 第二章 春秋兼用蚕品种润花镇月的选配研究 17 前言 17 料与方法 17 本选择 17 育环境设置 18 育经过及选择技术 18 择标准 19 区选择 19 体选择 19 果与分析 20 花、镇月的系谱成绩 20 交组合润花镇月的实验室鉴定 20 交组合润花镇月的农村生产鉴定 27 种性状 27 种性状 27 花镇月杂交种性状 28 论与结论 28 第二章 家蚕指纹图谱的构建 30 言 30 究的目的与意义 30 究进展 30 卫星标记(其应用 31 卫星标记在家蚕中的应用 31 于构建遗传图谱 31 于种质的鉴定 32 于研究物种的亲缘关系及起源 32 于基因定位和 定位克隆 32 于分子标记辅助育种 32 究的目标与预期结果 32 验方法 33 料与方法 33 料 33 材方法 35 要试剂 35 要仪器与设备 35 据分析软件 36 33 实验方法 36 因组 制备 36 度的测定 37 系及扩增程序 37 应所用的引物 37 应体系 39 增程序 39 泳检测 39 据分析 41 据的读取 41 据整理 41 据转化 41 据分析 41 果与分析 41 质量家蚕基因组 提取 41 增产物的初步检测 42 77 测序仪电泳检测 43 记的多态性分布43 品种 记的指纹图谱 44 品种 记的“0” “1”指纹图谱 44 传距离及聚类分析 44 传距离 44 类分析 45 论 47 47 纹图谱构建的理论基础 47 纹图谱的应用 48 种登记及杂交种纯度鉴定 48 纹库的建立 48 卫星的多态性 48 蚕品种的聚类分析 49 足之处 49 第四章 结 论 49 成了一对春秋兼用蚕品种 51 微卫星标记（建家蚕指纹图谱 51 微卫星标记（析家蚕品种资源的亲缘关系 51 微卫星标记（多态性分析 52 微卫星标记（开发与利用 52 参考文献 53 附录 1 指纹图谱表 57 附录 1 “10”图谱表 65 附录 3 遗传距离表 74 致谢 76 作者简历 77 第一章 绪论 第一章 绪 论 家蚕品种选配研究的目的与意义 家蚕起源于中国，具有 5000 年以上悠久历史。种桑养蚕、缫丝织绸是我国劳动人民的伟大发明，对人类物质文化生活和中国传统文明的传播及东西方文化交流等具有杰出贡献，故蚕丝业在我国有“功勋产业”之誉。 1970 年我国蚕茧产量超过日本而跃居世界首位，以后一直是蚕业生产第一大国。最高年产茧量达 75 万，丝类产量 8 万，分别占世界总产量的 75%以上和 70%左右，年生丝出口占世界生丝贸易量的 80%左右，年创汇 30 多亿美元（中国丝绸年鉴，2001 ）。我国还拥有 2000 多万户庞大的蚕农队伍， 100 多万从事茧丝绸行业的职工和工农业总产值近 500多亿元的茧丝绸生产、贸易、科教体系，它为发展我国国民经济，尤其是农村经济已经和正在发挥着重要作用。而茧丝绸行业的基础是原料茧的生产，其数量多寡，产品优劣，科技含量等左右着丝绸业的兴衰，因此抓丝绸贸易就必须从源头抓起。实践证明培育和推广优良品种是一项投资少、见效快、经济效益高的蚕业增产技术手段。党和政府非常重视选育和推广蚕品种，因此蚕品种选育一直都被列为重点攻关项目之一。 回顾中国近代家蚕育种的进步史，大致分为四个阶段（向仲怀，1995） ：1）从利用地方土种发展到杂交种；2）从饲养有色茧种发展到白色品种；3）从一化性品种发展到二化性品种，乃至具有多化性种血缘的强健性品种；4）由少丝量品种发展到多丝量品种，茧丝品质明显提高。 我国蚕品种的改良历经半个多世纪，建国以后历经“七五”“八五” “九五”“十五” ，组织全国大协作攻关，使家蚕新品种选育进展较快，春用品种主要经济性状较目前生产用种进一步提高，表现出优质多丝量的特点，缩小了与国际先进水平的差距， 茧层率达到 2526%， 茧丝长 14001500 米，出丝率 2021%，净度 93 分以上；夏秋用品种在重视强健性与提高出丝率相结合方面达到国际先进水平， 茧层率 2324%， 茧丝长 11001300 米， 接舒率 75%左右， 出丝率 1718%，净度 93 分以上。(何斯美，1996) 国内外品种选育进展 代我国现行蚕品种育成与推广 用蚕品种选育 以茧层率为例，野桑蚕的茧层率只有 7%8%，经过驯化逐渐演变为家蚕，到 1897 年在杭州成立西湖蚕学馆时，当时采用的诸桂、新元、大元等地方品种茧层率提高到 15%。本世纪 30 年代初我国开始推广改良种即一代杂交种瀚桂华桂、华五华六，茧层率提高到 1516%。此后，中国家蚕育种从自留种时代进入一个新的阶段（向仲怀，1995） 。 五十年代，孙本忠先生首创家蚕双杂交方法把当时生产上采用的五个品种， 28 个品系进行了1中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 整理，通过单交、顶交和双交试验，选拔出春种瀛汗华九、瀛汗华八。1958镇江蚕研所又培育成镇5镇8，镇5镇10，镇1镇2，苏16苏17；苏州蚕桑专科学校培育了浒1浒2。由于华九的产卵量多，华九漏翰产茧量高，而华八瀛翰丝质优良，所以 50 年代的长江流域春用当家品种为华九漏翰和华八瀛翰。其它多丝量品种对饲养技术和条件要求高，产量欠稳定，所以推广量较小。四川省 4 家单位联合选育了华10川l，该种大幅度地提高了蚕茧单产和茧丝长，成为四川省当家春用和秋用品种。广东省华南农大育成多化性品种南农 7 号（ 115 南九白海）。 六十年代，中国农科院蚕研所育种专家应用限性遗传原理，选育出了限性品种镇3改、镇4改，该品种当时茧层率达 25%，茧丝长达 1200 1300 米，出丝率 20%。还选育出一对四元杂交种新9新瀛（华9苏17瀛翰 苏16） ，弥 补 了 苏16苏17繁育系数低的弱点。安徽蚕研所育成华合东肥，该品种纤度偏粗而茧型大。四川省育成川蚕 3 号（蜀13苏13南6），该品种在国内开创了多元杂交组合的先河，具有杂种优势强、体质强健、产茧量高、丝质优等优点，在生产上迅速推广。 七十年代，中国农科院蚕研所育种者针对华合东肥繁育困难的情况选配了东肥617华合三元杂交种，年推广量曾占同期发种量的 1973 年通过引进和系统育种选出 731、732、753、 754、 781、 782 等几对优良组合，其中以 731732 的全面成绩最优，后更名为苏5苏6。该品种曾经以绝对优势占据了江、浙蚕种市场的近 20 年。通过杂交和系统选育，育成了丰产性多丝量蚕品种 688687，曾在生产上推广。同期广东省育成了一批品种有东34石37、东13石37等。四川省蚕研所育成川蚕 4 号（781782 734） ，从 1976 年推广，至今仍为四川和贵州的春用当家品种。 八十年代，可谓桑蚕品种选育的黄金时代。1980 年农业部成立了全国桑蚕品种审定委员会，在全国八个省所建立共同鉴定点，开展全国鉴定，20 年来审定合格通过并指定推广了春用品种13 对（沈兴家，2002） ，具有多丝量、高产、优质等特点，产生了巨大的经济效益。由中国农业科学院蚕业研究所育成了春用多丝量品种菁松皓月并开始在生产上推广，这是我国家蚕春用品种一块新的里程碑。该品种直到如今还作为春用品种的鉴定对照种，具有划时代的意义。其后，我国家蚕新品种层出不穷，先后育成了春蕾明珠春蕾镇珠、浙蕾春晓、苏花春晖、8278298268214 等春用品种。这些品种无论是在产量、茧质、丝质上都有较大水平的提高。春蕾明珠作为新的育种素材为今后攻关任务提供了良好的基础材料。 九十年代，我国蚕品种又跃上了一个新的台阶，育成了苏镇春光、皖 5皖 6，华峰雪松、苏菊明虎等。 我国主要蚕区的春用蚕品种经过四次大的更新换代，使春茧的出丝率和茧丝质都有了明显的提高，实验室成绩茧层率由 20%提高到 26%，出丝率由 15%提高到 20%以上，丝长由 900 米提高到1400 米以上，净度由 89 分提高到 95 分（赵远，2000） 。 表1 1980年he of 980 000 审定通 品种名 虫蛹率 全茧量 茧层率 万蚕收茧量 茧丝长 解舒丝长 解舒率 出丝率 净度2中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 过时间 （%） （g） (g) (m) (m) (%) (%) （分）1984 春蕾明珠 424 1131 松皓月 2 1427 1119 蕾春晓 402 1047 花春晖 425 1092 蕾镇珠 377 1024 42446 378 992 镇春光 402 908 5皖6 337 912 蕾锡方 380 928 613春日 340 989 蕾锡晨 394 990 丰富春 386 1018 瑞新明 419 991 386 1011 247 1022 364 974 266 858 照1为1981年至1984年的华合东肥，对照2、对照3为19931994年和19981999年的菁松皓月 秋蚕品种选育 我国夏秋蚕品种选育起步较晚，基础薄弱，但进展很快，在重视强健性与提高出丝率相结合方面达到了国际先进水平。 五十年代后期我国就逐步推广全年多次养蚕法，夏秋蚕比重逐年提高，现在已超过了春用种的发种量。当时育种家们通过对已有品种的研究与选拔，镇江蚕研所育成了华10瀛文，广东省华南农大育成多化性品种南农 7 号（ 115 南九白海），四川省 4 家单位联合选育了华10川l，这些品种的选育与推广实现了我国家蚕品种的第一次更新换代。 六十年代由华南农大育成强健性夏秋种 306华10，四川育成川蚕 2 号（蜀10南6）。由于这些品种耐高温且产量稳定，加之当时品种资源稀少，发种量曾占夏秋种总量的 90%。 七十年代，针对夏秋季气候条件恶劣，叶质较差，病虫害严重，夏秋蚕常常出现三低一短现象，急盼选育一批抗逆性强、产质量高、丝质优的优良夏秋蚕品种已成为当务之急。中国农业科学院蚕业研究所何斯美等根据遗传互补的原理，采取了突出两个对交原种的遗传差异和血缘差异（中系侧重茧丝量，日系侧重体质强，丝质优）育成了强健性夏秋用品种苏3秋3苏4，从而大大地提高了一代杂种的杂种强势率，较好地解决了长期以来存在的体质与茧丝质量难于统一的矛盾，本品种既保持了单交种的优良特性，又增强了抵抗力，且张种产茧量还得以提高。这是我国夏秋蚕品种历史性的突破（何斯美，1981）。同期该所还育成了东34苏12，无锡西漳蚕种场育成抗农药新品种菁花732，替补了 306华10在农药污染严重地区的推广与应用。 八十年代，由于全国桑蚕品种审定委员会的成立，夏秋蚕品种选育也进入黄金时期。由于乡镇3中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 工业的崛起，大气污染严重，尤其是氟污染，蚕桑生产在南方地区受到了很大挑战。针对这种情况，中国农业科学院蚕业研究所何斯美（1989）培育出国内首对耐氟品种丰一54A。该品种同时具有稳产、高产、茧丝质优的特点，还实现了夏秋蚕品种一粒茧丝长突破 1400 米大关，为乡镇工业发达地区提供了良种。同期又育成中秋用单限性多丝量四元种 57A57B2446，该品种强健好养，雌雄鉴别容易，繁育系数高，它的育成与推广大大提高了蚕种场的工作效益，并深受蚕农、丝厂的欢迎。同期全国各地也纷纷育成了适应于当地的品种，有江苏的秋丰白玉、75 新7532、浙江的浙农 1 号苏 12、薪杭科明、湖南的芙蓉湘晖、广东的两广 1 号、广蚕 3 号7532 等。 九十年代，夏秋蚕品种经过几次大的更