【毕业学位论文】水稻新型Ac-Ds标签突变体库的构建与分析博士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 博士学位论文 水稻新型 s 标签突变体库的构建与分析 of a c/ 士 研 究 生：栾维江指 导 教 师：孙宗修 研究员申请学位类别：理学博士 专 业：生物化学与分子生物学研 究 方 向：植物功能基因组学 培 养 单 位：中国农业科学院研究生院 中国水稻研究所提交日期 2006 年 6 月 of a c/ 006 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 水稻新型 s 标签突变体库的构建与分析 论文作者 栾维江 指导教师 孙宗修 研究员 培养单位 中国水稻研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 曹鸣庆 研究员 博导 北京农业生物技术研究中心 生物化学与分子生物学郑经武 教授 博导 浙江大学农业与生物技术学院 植物病理学评 阅 人 刘耀光 教授 博导 华南农业大学生命科学院 生物化学与分子生物学答辩 主席 周雪平 教授 博导 浙江大学生命科学院 生物化学与分子生物学王慧中 教授 硕导 杭州师范学院 生物化学与分子生物学陈剑平 研究员 博导 浙江省农业科学院 植物病理学庄杰云 研究员 博导 中国水稻研究所 生物化学与分子生物学钱前 研究员 博导 中国水稻研究所 生物化学与分子生物学陶跃之 研究员 硕导 浙江省农业科学院 生物化学与分子生物学余柳青 研究员 博导 中国水稻研究所 生物化学与分子生物学答 辩 委 员 答辩时间与地址 2006 年 6 月 15 日于中国水稻研究所 记录人员 朱 丽 摘 要 随着水稻精确图位序列的完成释放，水稻功能基因组学研究成为今后研究的热点和重要课题，建立突变体库是研究植物功能基因组一条重要而有效的途径。本研究利用含件的亲本系组配杂交组合，建立了大规模的插入突变群体，由于在体的特定位置插入了因，可以在秧田里直接从杂交后代中高效的选择转座系，大大节省了时间和劳动量的投入；系统的分析了和的转座频率和转座行为，并对产生的突变体进行了初步的研究。主要结果如下： 1 利用新型的 s 标签系统构建了水稻大规模插入突变群体，验证了新型 体中 因在田间大规模选择转座系的可靠性，可行性及有效性，结果发现 间选择与实验室鉴定结果高度符合，表明该系统适合于水稻大规模插入突变体库的构建。 2 为了构建插入突变群体，我们用 4 个 本系与 20 个 本系组配了 66 个不同杂交组合，株发生了高频率的体细胞转座，但未检出性细胞转座；共有 636 个株系及 137,437个单株，其中 36,160 个为转座植株。分析了 体的转座频率，发现来源于 s 3 和本系的 发生性细胞转座的频率较高，分别为 来自同一杂交组合的不同 妹系的转座频率有很大的差异，这种差异可能源自转座时间的不同； 3 个亲本系的 的性细胞转座频率主要集中在 30%围内。 3 4 个 本系中， 本系的 发生性细胞转座的频率很低，源于 265 个株系的 48,746个 株中，仅有 6 个株系的 203 个植株发生转座，可能发生了转座失活，转座失活的原因不是由 座酶失活所致，可能是在 本系中发生转座元件的失活。 4 分析了不同杂交组合方式（c 和 s）及 件的拷贝数对 性细胞转座频率的影响，发现正反交对性细胞转座频率没有影响；单拷贝的 件与两个拷贝的 件的性细胞转座频率差异不显著。 5 分析了 株旁测序列标签 (位点，发现 52 个 布于水稻的 10 条染色体上， 2个 布在原始 体位点附近，其余 50 个 布在原始 体位点较远位置，表明 件可以在全基因组范围内转座。 水稻的 10 条染色体上分布不均，第4 和第 11 染色体上插入的密度较大，占全部 54%。所分析的 52 个 ， 于预测的基因中。来源于相同 系的姐妹植株 位于水稻基因组中不同的位置上，表明 系姐妹植株可以发生独立的转座事件。 6 分析了 签系不同器官中的表达活性，发现 根、叶、幼穗及花中都具有表达活性，但对于不同的标签系，在不同器官中的表达活性有所差异，在植株发育的不同时期达活性也有所差异，表明了基因捕获器在转座标签系中的捕获作用。 7 利用 s 标签系统在 产生了一些可见表型的突变体，记录了这些突变体的表型性状和农艺性状；对矮杆卷叶突变体 t)的遗传分析初步表明： t)突变体为 入造成的、受一对隐性基因控制的突变体，该突变体对 感。 8 利用反向遗传学方法对标签系 行了分析，验证了 签在 因中插入位点；果表明 因是诱导型的表达方式，可以在不同的环境胁迫和渗透胁迫的诱导下表达，同源分析表明 白质与拟南芥 白质具有较高的同源性，但与水稻的 同源性较低。 关键词：水稻、s 标签系统、转座频率、旁测序列标签（、插入突变体库 of 005, on in a of is an In we a be to at We 1 2 as as c/Ds In a of 2 3 as 1. An . a c/Ds We in by in in CR in to 2. A 36 37,437 F2 6 6,160 37,437 F2 1 we to 1 s4 a of 2 2 of 0% 3. a of 65 F2 at of s of s We s 4. We of s/c/Ds）on no 5. s 2 0 by of 2 s on 1, 4% of to of 2 of 2 in on 2 6. We US in 3 US in in in in 7. A of by c/Ds 2 3 We t) by s t) 8. We of be by s 录 摘 要 . . . 献综述 . 1 稻基因组学研究.稻结构基因组学研究 .稻高密度遗传图谱和物理图谱 .稻基因组测序进展 . 水稻功能基因组学研究.稻功能基因组学研究内容 .稻功能基因组学研究策略 .究植物功能基因组的几种突变体库.建突变体库的意义 .变体库的种类及各自的特点 .发突变体库及其特点 .化诱变突变体库及其特点 .入突变体库及其特点 .c/.物转座子概况 .构及特点 .转座子类型、结构及特点及生物学意义 . .c/.c/.c/统的转座行为 .座元件活性的恢复 .座距离和转座热点问题 .入突变体库容量及插入突变体的表型问题 .研究的目的意义.第二章 水稻大规模 . 22 言 .料与方法.料 .物材料 .试验所用转化载体 .验方法 .稻基因组.测序列分析 .基因组甲基化分析 .列分析软件或工具 .果.配杂交组合的 .1 代植株 .2 代 .2 植株田间.2 插入标签群体及其转座频率 . 不同的杂交组合方式及 .论.用的、高效的大规模构建水稻插入突变体库的 座元件的失活 .座发生的时间及插入位点在水稻基因组中的分布 .第三章 . 46 言.料与方法.料 .法 .变体的形态观察 .稻基因.变体与野生型 .签系旁测序列的.物材料的诱导处理 .理 .株总.转录.列分析软件或工具 .果.c/.2 代突变体的表型及农艺性状调查.个矮杆卷叶突变体的遗传及生理的初步分析 .杆卷叶突变体的发现及表型 .杆卷叶突变体初步遗传分析 .杆卷叶突变体对外源激素反应 .个表型无明显变化插入标签系 反向遗传学分析.签系测序列及插入位点 .签系 入位点的验证 .因所编码蛋白质及同源性比较 .因的表达 .论.c/.向遗传学在 .入突变体及水稻 .第四章 进一步研究计划 . 63 第五章 全文结论 . 64 参考文献 . 65 附录 主要试剂配方 . 81 致 谢 . 84 作者简历 . 85 文缩写 英文全称 中文名称 s 主性转座子和非自主性转座子 细菌人工染色体 胺膦乙酰转移酶 厘摩尔根 he 磺隆抗性基因 二乙基焦碳酸盐 脱氧核糖核苷三磷酸(4 种) 二巯基苏糖醇 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 供体位点 始供体位点 测序列标签 霉素 色荧光蛋白 潮霉素磷酸转移酶 异丙基 际水稻基因组测序计划 卡那霉素 千碱基 养基 散布型重复序列元件 末端重复 甲基化敏感性扩增多态性 百万碱基 毫升 摩尔 I 新霉素磷酸转移酶 开放阅读框 工染色体 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 磷脂酰肌醇磷脂酶 C 录后基因沉默 随机扩增多态性 涉 每分钟转速 反转录十二烷基肌酸钠 十二烷基磺酸钠 散布型重复序列元件 霉素磷酸转移酶 标准柠檬酸钠盐溶液 单重复序列 he 450 细胞色素 温度不对称 NA 嗜热水生菌 合酶 5哚- 转移 端反向重复 n 因组局部诱变的定向检测技术 毒诱导的基因沉默 第一章 文献综述 第一章 文献综述 稻基因组学研究 基因组（一词最早是由 1920 年提出的，指生物的全部基因和染色体的组成，是由 个词合成的。1986 年美国科学家 出了基因组学（的概念，基因组学最初的内容是指基因组作图（和测序（。现在基因组学有了更广泛的内容，包括结构基因组学（和功能基因组学（。结构基因组学主要是构建高分辨率的遗传图谱（和物理图谱（，测定全基因组 列。功能基因组学则是利用结构基因组学所获得的大量数据及信息系统研究包括生化功能、细胞功能、发育功能及适应功能等在内的基因功能。 水稻结构基因组学研究 稻高密度遗传图谱和物理图谱 遗传图谱是应用遗传学原理构建的表明基因和其它特定序列在基因组位置的图谱，以遗传距离（厘摩，单位表示。物理图谱是指以具体的基因组 列的长度所绘制的图谱。通常是利用限制性内切酶或超声波等将染色体打断，构建 隆，经过测序后将各个叠连群组装成完整的染色体序列，也可以概括为含有路标顺序和标尺的克隆群，以物理距离碱基对（ 示。通过多年遗传标记的不断增加和定位，目前水稻已构建出了高密度的遗传连锁图，水稻 12 条染色体的遗传图谱总长达 第 1 染色体最长（181.8 ，第 10 染色体最短（83.8 。定位于连锁图上的遗传标记达 3267 个（et 2002; et 1998 ）。对应于其物理图谱，共有 3454 个不同的克隆被构建，测序总长为 (， 2005 年 4 月) 。起初遗传图谱和物理图谱是不对应的，通过不同研究者的发展正在逐步将两者对应起来。不同的克隆定位于连锁群上，同样，连锁群上的不同的遗传标记也可以在不同克隆中找到。 1中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 表 稻 12 条染色体的遗传图谱和物理图谱 ( ；2005 年 4 月 ) of in 色体 遗传图谱长度( 物理长度( 标记数 b) of 97 447 2 59 331 3 30 384 4 91 262 5 78 275 6 81 326 7 86 247 8 77 218 9 23 180 10 05 163 11 58 236 12 68 198 总计(453 3267 稻基因组测序进展 水稻是单子叶植物的模式作物，其基因组测序始于 1998 年的国际水稻基因组测序计划（，共有 10个国家参与了这个计划，并对水稻各个染色体的测序任务进行了分工。我国主要承担粳稻第 4 条染色体的测序任务。通过不同国家研究者的努力，到2002年日本、中国提前完成了第1 和第 4染色体的测序任务。同年，中国科学院基因组信息中心暨北京华大基因研究中心和美国 司利用全基因组鸟枪法（分别完成了籼稻93粳稻日本晴框架图的测序。这些结果于2002年分别发表于国际权威杂志（ et 2002； et 2002； et 2002； Yu et 2002）。为了获得高质量的水稻染色体全长序列， by 对水稻12条染色体进行逐条测序，最终于2005 年获得了水稻基因组的图位序列（ (2005)。从图位序列中我们可以了解到水稻基因组如下的信息：（1 ）水稻（日本晴）基因组为389成测序 370基因组的95，覆盖了常染色质区；共3041个盖水稻基因组的10 倍；断口（ 数为 62个( 包括9 个中心粒和17个端粒) ，。（2 ）检测到37,544个非转座子相关蛋白编码基因，个基因，其中2,859 个基因为水稻（禾谷类）独有；在预测的这些基因中，有17,016 个基因得到了全长支持，有 22,840（ 61%）个基因与已知的水稻有高的相似性。（3 ） 26,837个(71%) 预测的蛋白质能在拟南芥蛋白质组中找到同源物，26,004) 蛋白质能在水稻蛋白质组中找到同源物； 51的预测蛋白2中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 质与某个生物学过程有关，与代谢和细胞生理过程有关的蛋白质最多， （4 ）鉴定出11,487 个转座子插入位点， 3,243个在基因中。（ 5）共检测到 7