【毕业学位论文】四种类型甘蓝雄性不育系花药败育特征及基因表达谱分析博士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 四种类型甘蓝雄性不育系花药败育特征及 基因表达谱分析 . 博士研究生:康俊根 指 导 教 师:方智远 院 士 王晓武 研究员 申请学位类别:农学博士 专 业: 蔬菜学 研 究 方 向:蔬菜分子遗传育种 培养单位:中国农业科学院研究生院 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 提交日期 2006年06月 . 006 of 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 结球甘蓝（我国仅次于大白菜的第二大叶用蔬菜。由于结球甘蓝具有明显的杂种优势，目前全世界几乎所有主栽品种均为杂交种。利用雄性不育系生产一代杂种已经成为杂优育种的发展趋势。因而从分子和细胞学水平进一步探明不同雄性不育类型的花粉败育机理，揭示甘蓝雄性不育这一具有重大理论意义和经济价值的遗传现象的本质，有利于寻找或创造新的不育源，特别是有利于最终实现人工调控甘蓝雄性育性乃至实现对所有作物育性的人工操纵。 基于上述情况，本研究开展了以下四方面的研究工作： 1. 通过树脂超薄切片光学显微镜和电子显微镜观察结合，对黑芥胞质不育（ 隐性核不育（ 萝卜胞质不育（显性核不育（种甘蓝雄性不育类型进行了全面系统的细胞学败育特征研究； 2. 通过讨雄蕊发育相关基因的发育中断网络和途径； 3. 利用8张拟南芥全基因组寡核苷酸芯片(面分析了花药败育过程中所有基因的全局性表达，通过生物信息学手段充分挖掘和利用模式作物拟南芥在雄蕊发育相关基因方面取得的进展，为进一步阐明育性形成的不同功能途径调控网络提供重要的信息和线索； 4. 对目前最有应用价值的显性雄性不育的细胞学败育机理和相关基因的功能及调控机理进行深入研究，为最终实现人工调控显性雄性不育育性提供理论依据。 获得的主要结论如下： 1. 细胞学研究明确了四种雄性不育类型的主要败育时期和特征：要败育特征为绒毡层细胞分化和发育异常；B. 隐性核不育主要败育时期为花粉母细胞期，主要败育特征为绒毡层细胞和中层细胞异；C. 萝卜胞质不育主要败育时期在四分体前期，败育特征主要表现为从减数分裂后期开始绒毡层细胞活动异常,绒毡层细胞进行性加厚；D. 显性核不育主要败育时期在四分体后期，主要败育特征是小孢子不能自由释放，但花粉壁能正常沉积孢粉素，本实验另一个重要发现是，显性不育败育的直接原因并不是已经发现的包裹四分体的胼胝质壁延迟降解，而是包裹整个四分体的花粉母细胞（生壁的持续存在。 2. 利用结合不同材料败育时期特征分析认为，大部分（雄性育性相关基因的表达具有典型的顺序发育特征。 提出了甘蓝花药发育相关基因的顺序表达模型，初步揭示了花药发育过程中，多数基因表现为以线性模型在不同时期顺序表达。而E、F、G、5种表达模式为不符合顺序表达模式的育性相关基因，推测可能是各种孢子体组织独立或与小孢子协调表达的旁路基因。进一步对代表不同类型的23条因参与细胞壁水解酶功能。 3. 芯片试验的结果表明，这四种雄性不育类型败育的根本原因都是由于绒毡层的异常干扰了小孢子的正常发育。对胞质不育类型特异下调的三种重叠关系的基因功能分析发现，种胞质不育类型线粒体功能异常对甘蓝发育的影响的分子机制近似于对生理刺激或环境胁迫的应激反应功能的下降或丧失。同时我们筛选出89个药壁组织中特异表达的基因（主要是绒毡层特异表达的基因）。进一步比较药壁 现药壁组织中转录因子比例较高而激酶类基因比例则较低。 4初步探讨了显性雄性不育败育的分子机理。其大量差异表达基因是涉及到细胞壁代谢相关的基因或调控细胞壁代谢相关的基因，但直接参与胼胝质降解（下调基因并不多。表明胼胝质延迟降解不是（至少不是主要的）显性不育小孢子不能分开的原因。个途径包含五个我们检测到的显著下调的多聚半乳糖酶基因。显性雄性不育败育的分子机理可能是：而造成花粉母细胞初生壁的持续存在，并最终引发花粉正常发育所必须的大量雄配子体内表达的基因功能网络体系的瓦解。因此，我们可以推测，这13个可能的绒毡层特异表达的基因应该是许他们共同受许，他们其中之一本身就是我们正在寻找的关键词：甘蓝，雄性不育，败育特征，因表达谱 is an a of in to of In to on we as to of of to of as 1of at of at in of of be by 2of to by of In we 13 2 76 of , B, C , in of in as a 3 of 3 we of 209 of to as of We of of at of of of MS as by of of of MS in in of MS of or of of we 9 in 4of as a It be of of of at of of a of of 77 251 ( 38 in 3 in We of in MC in of a of in we 3 be in of or of we 语 互补 细胞质雄性不育 互补 4,6 4,6 别显示 二乙基焦碳酸酯 显性核雄性不育 二硫苏糖醇 细胞核雄性不育 基因实体注释 慕尼黑拟南芥蛋白序列信息中心数据库 T 黑芥胞质雄性不育 聚乙烯乙二醇 花粉母细胞 果胶甲酯酶抑制因子 初生壁细胞 初生造孢细胞 隐性核雄性不育 反转录 次生壁细胞 抑制性扣除杂交 拟南芥信息资源数据库 转录差异片段 录 摘 要. 略语. V 目 录.一章 前言. 1 蓝雄性不育的类型及分子生物学研究进展. 1 蓝雄性不育的类型. 1 蓝细胞核雄性不育. 2 蓝细胞质雄性不育. 3 蓝雄性不育小孢子发育的时空特征. 3 蓝雄性不育的分子机理研究进展. 5 质不育线粒体基因和核基因的互作表达. 5 蓝显性核不育基因的分子生物学研究. 6 蓝雄性不育的应用. 7 蓝雄性不育分子机理研究的问题及展望. 7 南芥雄蕊发育相关基因的研究进展. 8 性器官建成的相关基因的功能和调控. 8 原细胞分化及小孢子囊形成相关基因的功能和调控. 12 粉母细胞发育的调控机理. 13 数分裂相关基因的功能及调控机理. 13 孢子释放及不对称分裂相关基因的功能及调控机理. 14 药开裂的分子调控机理. 15 制花粉萌发和生活力相关基因的调控. 17 物雄蕊发育相关分子机理研究的意义. 17 研究的目的和意义. 18 第二章 不同甘蓝雄性不育花药败育特征分析. 20 料与方法. 20 验材料. 20 验方法. 21 学半薄切片制备和观察. 21 射电镜样品制备和观察. 21 果与分析. 22 育花药及小孢子发育过程. 22 芥胞质不育花药及小孢子发育过程. 22 性核不育花药及小孢子发育过程. 23 卜胞质不育花药及小孢子发育过程. 23 性核不育花药及小孢子发育过程. 24 论. 24 种雄性不育类型花药发育的主要败育特征比较. 24 种雄性不育类型花药发育的主要败育时期的确定. 25 壁组织与小孢子的协调作用. 26 结. 27 第三章 利用. 45 料与方法. 45 验材料. 45 蕾总. 45 链. 46 . 46 异片段回收，克隆测序及序列分析. 47 果与分析. 48 异表达的多态性分析. 48 种雄性不育. 49 异表达. 49 异表达. 50 论. 52 结. 55 第四章 四种甘蓝雄性不育基因芯片表达谱分析. 56 料与方法. 56 验材料. 56 . 57 因芯片探针标记和杂交. 57 据的获得和处理. 59 证及分析. . 59 果与分析. 60 种甘蓝雄性不育类型基因芯片数据可靠性分析. 60 用四种甘蓝雄性不育类型检测到的花发育相关基因. 62 种甘蓝雄性不育类型基因芯片差异表达分析. 63 分基因芯片数据的 证. 64 种甘蓝雄性不育类型检测到的育性相关基因聚类分析. 65 种雄性不育类型败育机理分析. 68 性育性相关基因的重叠关系及功能分析. 71 用生物信息学手段筛选花药优势表达基因. 74 壁组织中特异表达的基因. 74 论. 78 结. 81 第五章 显性雄性不育花药败育机理和相关基因功能调控分析. 82 料与方法. 82 验材料及数据处理方法. 82 光显微观察方法. 82