【毕业学位论文】表达犬瘟热病毒F 和H 基因的重组犬2 型腺病毒的构建论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 表达犬瘟热病毒 F 和 H 基因的重组犬 2 型 腺病毒的构建 ( 博士研究生: 周 洁 指 导 教 师: 陈洪岩 研究员 申请学位类别: 农学博士 专业:预防兽医学 研究方向: 动物病毒分子生物学与免疫学 培养单位: 中国农业科学院研究生院 哈尔滨兽医研究所 提交日期 2007 年 6 月 ( 2007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 表达犬瘟热病毒 F 和 H 基因的重组犬 2 型腺病毒的构建 论文作者 周 洁 指导教师 陈洪岩 培养单位 哈尔滨兽医研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 评阅人 盲 评 答辩 主席 华育平 教授 博士导师 东北林业大学 野生动物 疾病防制 刘文周 教授 博士导师 东北农业大学 预防兽医 师东方 教授 博士导师 东北农业大学 预防兽医 童光志 研究员 博士导师 哈尔滨兽医研究所 预防兽医 刘胜旺 研究员 博士导师 哈尔滨兽医研究所 预防兽医 于 力 研究员 博士导师 哈尔滨兽医研究所 预防兽医 曲连东 研究员 博士导师 哈尔滨兽医研究所 预防兽医 答 辩 委 员 答辩时间与地址 2007/06/16 哈尔滨兽医研究所 记录人员 高玉龙 I 摘 要 犬瘟热 (由犬瘟热病毒 (染引起的急性、高度接触性传染病，是当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疾病之一。 虽然常规弱毒疫苗在控制 也存在难以克服的缺点，弱毒苗可引起免疫抑制和中枢神经系统的损坏，随着 毒疫苗的使用还可能致死某些易感动物并带来散毒的危险。因此研制安全、高效的犬瘟热疫苗具有重要的实际意义。活载体疫苗具有成本低、效果好和使用安全、方便等诸多优点。犬 2型腺病毒 (弱毒株是批准用于犬传染性肝炎和犬传染性喉气管炎免疫预防的疫苗株，其 失或插入外源基因不会影响病毒的复制。因此， 研究旨在构建表达 3区缺失的重组 达到同时预防犬瘟热、犬传染性肝炎和犬传染性喉气管炎的目的。 本研究首先从 苗株中提取了全基因组，克隆了包括 及其侧翼序列 p基因和部分 因在内的 4164基因片段。对该片段的核苷酸序列及氨基酸序列的分析结果表明 全长 1504向有 2 个开放阅读框，分别编码大小为 13.3 40.7 两个多肽。其中 肽的基因编码框与 p基因的编码框有部分重叠。距 起始位置的上游 340发现一 测为 的启动子序列。将该片段的序列与强毒株 26/61 株进行比较后发现二者在 仅有 2 个碱基不同，氨基酸同源性则为 100，由此推断编码的蛋白对 毒力没有影响，这一结果为构建 缺失载体提供了理论依据。 根据对 别选取基因组中 240502495363627238下游同源重组臂，针对这两段序列设计两对 切位点，将扩增的两目的片段顺次克隆于 失了 14123区序列，并在缺失位置插入了 克隆位点，增强型绿色荧光蛋白基因（ 建了 该载体转染 过连续 6轮蚀斑筛选获得了表达绿色荧光蛋白的重组病毒单一克隆株 鉴定 物试验证实 研究为进一步开展 在成功构建了重组病毒 基础上，利用 增得到了犬瘟热病毒( 株的融合蛋白基因（ F）和血凝蛋白基因（ H），对其进行序列分析后将 F 和 H 基因分别用 酶消化后，定向插入到载体 ，替代了 因，构建了重组转移载体 亲本病毒，反向蚀斑筛选、纯化获得了表达 F 及 H 基因的重犬 2 型腺病毒 接免疫荧光试验与 验均证明 和 H 基因分别在在 染 胞中获得表达， 并具有良好的反应原性， 为下一步重组活载体疫苗的研究奠定了基础。 为了配合 以鉴别重组病毒疫苗免疫的动物和自然感染 本研究利用基因工程抗原建立了检测 照 衣壳蛋白 (N)基因的核苷酸序列设计合成一对引物， 扩增了 基因，经序列测定和分析后，将其定向克隆于原核表达载体 构建的重组质粒 3蛋白，经 蛋白具反应活性；用纯化后的蛋白作为抗原，建立了间接 阻断试验、交叉反应试验、敏感性试验及与进口试剂盒 感性，能够为我国在犬瘟热病流行病学调查及疫苗的免疫效果的监测等方面提供技术支持。 关键词 ：犬腺病毒，重组病毒，犬瘟热病毒，融合蛋白基因，血凝蛋白基因，核衣壳蛋白基因，间接 by is of in in D: it it be a So as (is to be in E3 is to it of to or of to of is to a DV D, In we 164bp 3 its p 3 504bp in in 3.3 0.7 A at 40bp 3 it to 3. 3 26/61 of 00%. we 3 no 3 we 405024953bp 636227238 bp as to at of of CR 412bp 3 by a E a 3 as on as of CR of be We of In IV a of on as by by be in So be as a D. To a on DV In 3of as a of of is as be a of DV V 目 录 前 言 . 犬瘟热概述 .瘟热病毒的结构特点 . 2 瘟热病的免疫预防 . 4 2 腺病毒载体的研究进展 .病毒载体构建的理论基础 . 7 1 区的结构与功能 . 8 3 区的结构与功能 . 9 4 区的结构与功能 . 9 病毒载体的类型 . 10 助病毒依赖缺陷型腺病毒载体 . 10 殊细胞依赖缺陷型腺病毒载体 . 10 依赖型腺病毒载体 . 11 病毒载体的优越性 . 11 病毒载体的应用 . 13 病毒载体在基因治疗中的应用 . 13 病毒载体在人载体疫苗中的应用 . 13 病毒载体在动物载体疫苗研究中的应用 . 14 3 犬腺病毒及犬腺病毒载体 .腺病毒的基本生物学特性 . 15 腺病毒基因组结构特点 . 16 组犬腺病毒载体的构建 . 17 4 本研究的目的及意义 .究报告 .验一 犬 2 型腺病毒疫苗株 及其侧翼序列的克隆与序列分析 . 材料与方法 .胞、病毒和菌种 . 21 要试剂 . 21 毒扩增 . 21 物 . 21 毒基因组的提取 . 21 的基因的扩增 . 22 . 22 肠杆菌感受态细胞的制备 . 22 化 . 22 裂解法小量提取质粒 . 23 组质粒的序列测定与分析 . 23 2 结果 .3 区及其侧翼序列的 . 23 列分析结果 . 24 3 讨论 .验二表达绿色荧光蛋白的 失重组犬 2 型腺病毒的构建及其生物学特性分析 . 材料和方法 .毒、载体及细胞 . 31 要试剂 . 32 验动物 . 32 3 缺失转移载体的构建 . 32 量法提取 . 34 本病毒 . 34 组质粒的转染 . 35 组病毒的筛选及纯化 . 35 组病毒的 . 35 组病毒生长特性的鉴定 . 36 组病毒的形态学鉴定 . 36 组病毒遗传稳定性检测 . 36 组病毒作为疫苗载体的安全性评估 . 36 2 结果 .3 缺失转移载体的构建 . 36 组病毒的筛选及纯化 . 41 一克隆 . 42 组病毒的形态学鉴定 . 43 组病毒的生长特性 . 44 传稳定性检测 . 45 组病毒的安全性评估 . 46 3 讨论 . 于 及其缺失后的容量 . 47 于报告基因的选择 . 48 于转染的方法 . 49 于重组病毒的筛选 . 49 于重组病毒生物学特性的鉴定 . 49 实验三 和 . 材料及方法 .毒和细胞 . 52 粒 . 52 要试剂 . 52 . 52 瘟热病毒的增殖