【毕业学位论文】流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2 株全基因组序列分析及E 蛋白抗原表位鉴定博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 流行性乙型脑炎病毒 全基因组 序列分析及 E 蛋白抗原表位鉴定 交日期 2007 年 6 月 博 士 研 究 生： 闫丽萍 指 导 教 师： 童光志 研究员 申请学位类别： 农学博士 专 业： 预防兽医学 研 究 方 向： 动物病毒分子生物学与基因工程 培 养 单 位： 中国农业科学院研究生院 哈尔滨兽医研究所 2007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 流行性乙型脑炎病毒 全基因组序列分析及 E 蛋白抗原表位鉴定 论文作者 闫丽萍 指导教师 童光志 培养单位 哈尔滨兽医研究所（研究所）姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 吴东来 研究员 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学王君伟 教授 东北农业大学 预防兽医学评 阅 人 刘文周 教授 东北农业大学 预防兽医学答辩 主席 李一经 教授 东北农业大学 预防兽医学魏萍 教授 东北农业大学 预防兽医学李书华 研究员 兽医卫生防疫站 预防兽医学刘长明 研究员 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学王云峰 研究员 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学薛飞 研究员 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学答 辩 委 员 答辩时间与地址 记录人员 中国农业科学院博士学位论文 摘 要 I 摘 要 流行性乙型脑炎（ 由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒（ 起的一种以蚊虫为媒介传播的人和动物共患的病毒性疾病，对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，对猪可引起繁殖障碍，给养猪业造成巨大的经济损失。猪是 中间宿主，带毒猪是本病的主要传染源。因此，控制猪的 仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。 本研究首先根据已发表的 基因序列设计合成了 4 对引物，通过 毒 经 胞传至第 20 代的毒株 扩增得到了覆盖 毒基因组全长的 4 个 段，将所得片段克隆至 体上，经测序和拼接后，获得了 因组全序列（ 。序列分析表明，该 因组全长 10 977有 1个大的开放阅读框架，编码 1 个由 3 432 个氨基酸残基组成的聚合蛋白，其 5非编码区和 3非编码区分别由 95 和 583 个碱基组成。将此全序列与 病毒株核苷酸、氨基酸进行比较，同源性均在 99%以上，突变位点分散于各个区域，而且发现 些位点和 A）及野毒株 苷酸、氨基酸序列相同而与疫苗株 同，推测这些区域可能与减毒没有关系。发现 3非编码区第 10 701 位插入一个碱基 G。比较了 31 株 序列的 3非编码区，结果提示 10 701 位碱基 G 插入区域可能是 变位点。将 列与 表的 31 株 序列进行同源性分析， 以进一步了解 间的遗传进化关系。本研究所获得的 全序列测定，一方面有助于揭示病毒的致病和减毒机理，另一方面也为减毒活疫苗生产的质量控制，主要为监控可能发生的回复突变提供分子基础。此外，病毒基因组全序列 隆的建立为进一步进行感染性克隆的研究奠定了基础。 E 蛋白是 主要结构蛋白，在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。本试验通过 增 1291、 292402 403500 3 个片段， 物分别定向克隆到表达载体 ，经诱导各融合蛋白均以包涵体的形式表达。兔抗 毒血清的 果均表明 段 1402 E 蛋白的免疫优势决定区。为对这一免疫优势区域进行抗原表位鉴定，设计一套 52 个部分重叠的短肽，这些短肽覆盖全部 1402段。将每一个短肽基因序列分别合成一对寡核苷酸链，退火后插入表达载体 行融合表达，多数表达的融合蛋白以可溶解的形式存在。用 性血清进行 描，鉴定出 11 个抗原表位，分别为 116 、 7388 、 8196 、 145160 、 257272 、 305320 、 353368 、 369384 、 377392 、 385400 373388 。通过 白免疫印记对鉴定的抗原表位进行精细分析，最终确定为 9 个抗原表位： 116 、 7784 、 8394 、 145160 、 中国农业科学院博士学位论文 摘 要 33（ 257272 、 305320 、 359362 、 377384 、 385400 。应用此 9 个融合蛋白对小鼠进行免疫，结果表明 9 个融合蛋白均能诱导小鼠产生针对短肽的特异性抗体。且通过中和试验鉴定出 7388 、 305320 线性中和表位。其中表位 现有的报道区域重叠，另一个中和表位 新确定的。将鉴定的 9 个表位合成多肽，混合包被 ，证实可以用于检测猪血清。本研究对 E 蛋白进行抗原表位的鉴定，将有助于进一步阐明 E 蛋白的结构与功能，将为建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法和基于表位疫苗的设计研究提供重要的研究工作基础。 关键词： 乙型脑炎；序列测定； E 蛋白；抗原表位 中国农业科学院博士学位论文 a of is to it is as a EV in is an E in of it is to E, is as as of 0,977a a ,432 by 95 at 83 at of of 9%, in at ), at It a G of 0,701 In 1 EV be to 1 EV be EV of be to in of on of In EV be of a is of In 1291 292402 403500 of by ST in a 402aa of To of a 2 402aa ST 116 7388 8196 中国农业科学院博士学位论文 145160 257272 305320 353368 369384 377392 385402 63 (373388 116 7784 8394 145160 257272 309316 359362 377384 49 (385402 of of 388 305320 as to EV of E, of 中国农业科学院博士学位论文 目 录 V 目 录 文献综述 . 病原与流行病学 . 1 行现状 .原学 .播媒介和传染源 .地区传播机理 . 致病机制 . 4 3 苗的研究进展 . 5 活疫苗 . 鼠脑纯化灭活疫苗和地鼠肾细胞灭活疫苗 . 胞 化灭活疫苗 .毒活疫苗 . 疫苗生产用弱毒毒株的选育历史 . 苗的应用 .因工程疫苗 . 基因工程亚单位疫苗 . 合成肽疫苗 . 组活疫苗 . 11 酸疫苗 . 子生物学研究进展 . 14 因组结构及特点 .毒蛋白 . 结构蛋白 . 非结构蛋白 .中国农业科学院博士学位论文 目 录 蛋白表位研究 . 诊断 . 21 毒分离鉴定 .清学诊断方法 . 补体结合试验 . 血凝抑制试验 . 中和试验 . 酶联免疫吸附试验 . 乳胶凝集试验 . 斑点金免疫渗滤检测法 . 微量免疫荧光法 .规抗原检测方法 . 免疫细胞化学法 . 反向被动血凝试验 . 荧光抗体染色法 . . 目的意义 . 25 实验一 基因组克隆及序列分析 . 27 1 材料方法 . 28 毒、质粒、菌株及细胞 . .物设计 .苗株 提取、 克隆 . 疫苗株 细胞培养 . 病毒基因组 提取 .中国农业科学院博士学位论文 目 录 段扩增 长 . 段的克隆 . 阳性重组子的筛选与鉴定 .长 隆分子的构建与鉴定 .2 实验结果 . 33 因组的各重叠片段的扩增 .克隆片段基因酶切及 定结果 .克隆片段测序结果的拼接 . 病毒株序列比较 . 多样性 .因组全序列进化树分析 .长 隆分子的鉴定 . 讨论 . 41 基因组的稳定性 .全长 获得 .验二 苗株 E 蛋白的分段表达与免疫性分析 . 45 1 材料方法 . 45 粒、菌种及 E 基因 .清、抗体及试剂 . 基因片段的 增 . 片段表达质粒的构建 .组质粒的诱导表达 .达产物的 析 .达产物的 析 . 结果 . 48 中国农业科学院博士学位论文 目 录 增 .组质粒的构建与鉴定 .组质粒的诱导表达 .达产物的