【毕业学位论文】猪繁殖与呼吸综合征病毒与宿主细胞受体之间相互作用的研究及病毒遗传变异分析博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 猪繁殖与呼吸综合征病毒与宿主细胞受体之间相互作用的研究及病毒遗传变异分析 on of of 博士研究生：安同庆 指 导 教 师：童光志 研究员 申请学位类别：农学博士 专 业：预防兽医学 研 究 方 向：动物病毒分子生物学与基因工程 培 养 单 位：中国农业科学院研究生院 哈尔滨兽医研究所 提交日期 2007 年 6 月 on of of 2007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导 师 签 名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 猪繁殖与呼吸综合征病毒与宿主细胞受体之间相互作用的研究及病毒遗传变异分析 论文作者 安同庆 指导教师 童光志 培养单位 哈尔滨兽医研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 评 阅 人 答辩 主席 李一经 教 授 博 导 东北农业大学 预防兽医学 魏 萍 教 授 博 导 东北农业大学 预防兽医学 李书华 研究员 博 导 黑龙江省动物卫生防疫站 预防兽医学 刘长明 研究员 博 导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 王云峰 研究员 博 导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 薛 飞 研究员 博 导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 周建华 研究员 博 导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 答 辩 委 员 答辩时间与地址 2007年6月14 日 哈尔滨兽医研究所 记录人员 刘永刚 I 摘 要 猪繁殖与呼吸综合征（ 以妊娠母猪繁殖障碍及各年龄阶段猪呼吸道症状为主要特征的传染病。其病原猪繁殖与呼吸综 合征病毒（ 有典型的嗜单核细胞 /巨噬细胞特性，在体内， 要感染猪肺泡巨噬细胞（ 。 研究发现在 胞上存在 3 个受体：硫酸乙酰肝素（ 唾液酸粘附素（ 子。三者之间的关系大体为： 要作用是吸附 导 内吞， 能起协助 吞、病毒脱衣壳和将基因组 放到细胞质中的作用。 成 入 胞的第一个环节， 合是实现内吞的必要步骤。但是迄今为止 体上参与病毒结合的部位，病毒上参与受体结合的蛋白及其结合位点还不得而知。 为确定 体上参与病毒结合的结构域，本试验从 胞中经 增出编码 克隆到 体中，得到表达 体的真核表达载体。猪 胞为 允许细胞，将表达载体转染 胞后接种 后利用针对 单克隆抗体进行间接免疫荧光检测病毒的吸附情况。 结果发现表达有 白的 胞可以结合此基础上，本试验进一步将该受体基因分割成几段进行转染 胞、检测细胞与病毒的吸附能力，最终发现该受体的第一个结构域（ 20独转染的 胞可以介导吸附。继而利用大肠杆菌原核表达系统对该结构域进行了原核表达，目的蛋白经纯化后免疫试验兔并制备了针对该结构域的兔高免血清。该高免血清可以明显抑制病毒与 胞的吸附。试验证实唾液酸粘附素受体的第一个结构域参与 胞的吸附。 分析结果显示，在 结构蛋白中均不存在七肽重复序列，特别是在 有的两个 I 型膜蛋白 也没有发现七肽序列。这表明 入 胞不是 I 型膜融合机制，而是按照其它类型的机制进行的。为分析 参与受体分子结合的病毒囊膜蛋白，本试验从 病毒囊膜蛋白与宿主细胞 别利用针对 N 蛋白的单克隆抗体进行间接免疫荧光检测。结果发现 白的单克隆抗体检测不到荧光。 N 蛋白单克隆抗体能检测到少量荧光。由于 N 蛋白位于病毒粒子的内部，一直以来被认为不参与受体的结合。存在少量荧光，可能是在提取的膜蛋白残留少量的完整病毒粒子所致。通过以上试验，可以认为 白参与了受体的结合。另一方面， 白的荧光集中在细胞的表面，同时 白的拓扑结构分析显示， 受体结合后有可能引起局部自由能的升高，从而可能导致病毒结构的变化，因此推测，除 白以外的其他囊膜蛋白有可能参与了 吸附与内吞。 白在不同的 离株中遗传变异较大。 本研究收集了我国大陆自 1996 年首次发现 来至 2006 年初的 42 株 列，其中包括 录的所有的大陆分离株 列 27 株，从现地病料中自行分离的毒株序列 15 株。对这些毒株的 列分析结果表明：所检测的 42 株 为北美洲型；尤为注意的是我国这些毒株可以分为差异极大的 个亚群，在整个北美洲型毒株的进化树上呈明显的两极分布。亚群 1 毒株在氨基酸序列上与亚群 2 有着很大的差别，特别是亚群 1 毒株在主要中和表位 列中高度变异，而且潜在的毒力相关位点也与强毒相同。另外，亚群 1 与我国广泛使用的弱毒苗和灭活苗的亲缘关系较远。因此从一定程度上讲，亚群 1 毒株具有毒力较强、逃避机体体液免疫的潜质。地理分布显示，亚群1 主要集中在我国的东南沿海地区。 2006 年春夏交接之际，我国南方发生以高热、高发病率和高死亡率为特征的猪病，而后迅速蔓延至周边地区，至 2007 年已遍及全国绝大部分省份。目前认为该疫情是由高致病性 异株及其他病原微生物混合感染并在高温高湿等诱因条件下所致。本研究对我国 20062007 年多个省份分离的高致病性 异株进行了全基因组序列分析，结果显示这些毒株各蛋白的氨基酸序列之间同源性极高，有的甚至可达 100%，而且遗传变异特征相同，因此它们可能来源于同一个祖先。 而且 异株与现地应用的疫苗株之间的亲缘关系较远。 异株 白存在 2 处共 30 个氨基酸的缺失，缺失位置处于 组成差异区，序列比对发现该区在以往的多个分离株中也存在缺失，因此推测该缺失可能与病毒毒力增强无关。 异株 变异有可能参与了病毒毒力增强和逃避机体免疫。 关键词 ：猪繁殖与呼吸综合征，受体，唾液酸粘附素，结合域， 传变异 to a in to be in to HS no Sn is a in NA It on or as a as a HS in n on n, to is of is to n n AM a to a by of 8FA be by n a of in a in of to AM In by an of on at n) to be 9 50 of n, in 20to be in to by AM By we of in a is if be by is no in do to AM by a of P5 to be or to be To of we IV 996 006 in P5 by 7 60 As a to 2 In on of of in of no at in . In , to be On to As to in to be A in by 006, in to be of In 5 in A 0 in of P5 in V 目 录 第一章 绪论 引言 .繁殖与呼吸综合征 . 述 . 子生物学特征 . 疫学与致病机制的研究进展 . 遗传变异 . 疫苗与防治 .毒的细胞受体 . 病毒受体的概述 . 病毒侵入宿主细胞的过程 . 鉴定受体的方法 .繁殖与呼吸综合征病毒受体的研究进展 . 位于 胞上的受体 . 位于 胞上的受体 .究目的和意义 .二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒宿主靶细胞受体结合域的鉴定 料和方法 . 毒株、细胞、菌种、表达载体、抗体 . 实验动物 . 主要试剂与药品 . 仪器设备 . 胞总 提取及唾液酸粘附素全长基因的克隆 . 全长 组质粒的纯化、转染与其介导病毒结合能力的检测 . 段表达载体的构建与其介导病毒结合能力的检测 . 构域表达载体的构建与其介导病毒结合能力的检测 . 氨基端结构域短肽的原核表达，蛋白纯化及高免血清的制备 .0 高免血清抑制病毒与转染细胞的吸附 .1 高免血清抑制病毒与 胞的吸附 .果 . 因的获得 . 真核载体的构建 . 全长唾液酸粘附素介导病毒的结合 . 分段唾液酸粘附素介导病毒的结合 . 结构域唾液酸粘附素介导病毒的结合 . 氨基端短肽的原核表达与抗血清制备 . 抗血清抑制病毒与转染 胞或 胞的吸附 .论 .三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒中参与受体结合的病毒蛋白 料和方法 . 毒株、细胞与抗体 . 实验动物 . 主要试剂与药品 . 仪器设备 . 病毒囊膜蛋白中七肽重复序列的分析 . 胞的制备与培养 . 病毒的纯化 . 病毒囊膜蛋白的提取 . 病毒囊膜蛋白与 胞的结合 .果 . 囊膜蛋白中不包含七肽重复序列 . 囊膜蛋白提取物与 胞的结合 .论 .四章 我国大陆 1996初猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株白的遗传变异与拓扑结构分析 料和方法 . 临床样品 . 毒株的地理分布 . 白的进化树分析 . 白的氨基酸序列分析 .果 . 所检测的我国分离株均为北美洲型 . 我国大陆分离株呈明显的两极分布态势 . 发生变异的关键氨基酸 . 亚群间其他特征性变异 . 毒株的地域差异分布 . 我国大陆分离株与疫苗株的关系 . 白的拓扑结构 .论 .五章 我国大陆 2006猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的遗传变异分析 料与方法 . 全长基因组序列来源 . 异株全长基因组的进化树分析 . 异株各蛋白的氨基酸同源性分析 . 异株二级结构、抗原性的变化 . 潜在毒力相关位点的分析 . 白缺失部分的分析 . 白变异与可能的功能改变 . N 蛋白变异与可能的功能改变 . 5 翼序列 构的改变 .果 . 异株与现行疫苗株的亲缘关系较远 . 异株的氨基酸同源性分析 . 异株的高变区 . 潜在毒力相关位点的比较分析 . 白缺失部分的分析 . 白变异与可能的功能改变 . N 蛋白变异与可能的功能改变 . 构的变异 .论 . 论 .考文献 . 录 . 谢 .者简历 . 表 清 单 插图清单 图 1繁殖与呼吸综合征在全球范围内的流行与分布 . 1繁殖与呼吸综合征病毒的分类地位 . 1繁殖与呼吸综合征病毒粒子电镜图