【毕业学位论文】（Word原稿）烟草对马铃薯Y病毒抗性遗传分析植物病理学硕士论文

I 密级： 论文编号： 中国农业科学院 学 位 论 文 烟草对马铃薯 Y 病毒抗性遗传分析 of to F of to 摘 要 烟草马铃薯 Y 病毒病（ 世界范围内烟草一重要病害，每年给烟草生产带来巨大损失。在目前缺少有效的防治药剂的情况下，种植抗病品种是防治 一个最经济、最有效的措施。然而，当前国内烟叶生产中尚没有高抗 烟草栽培品种。为研究烟草 病遗传机制，加速 论支持和数据参考，分别在 2003年选用 ）、 ）、 ）、 ）、 ）和 ）六个烟草品种，在 2004年选用 ）、 ）、 ）、 ）、和 ）五个烟草品种，在中国农业科学院烟草研究所进行了如下试验。按完全双列杂交方法，分别获得 P（ 在次年连同 用 )分析法和 算配合力和遗传参数。 结果发现， 同品种、不同组合间抗病性存在极显著差异。 般配合力最高，其次 对 值亲本 ；次 对 本 。 通过 个亲本的特殊配合力均表现较高，有进一步研究利用的价值。 性遗传中加性效应是主要的，同时存在部分显性，没有上位互作效应，符合加性 显性模型。 4. 参 试品种中的显性基因和隐性基因的数量不同，抗病品种中 有较多显性基因， 有较多的隐性基因，它们对 性是由显性基因控制的， 时对感病基因进行了分析，感病品种的感病机制也不同， 感病性是由较多的显性基因控制的， 感病性是由隐性基因控制的，环境对显性基因的表达有较大影响。 2003 年 2004年 ， 抗性基因可以通过基因累加的方式在后代中表现出来， 宜早代选择。 关键词：烟 草，双列杂交， 合力，遗传抗性分析 (is a of is no to in In to ), ), ), ), S) 326 (S) 003,), ),), ) 326(S) 004， to to 1/2P(P+1)F1 of in in on by ) to of of of no of by by by by on of 5. in 003， 004)， be in is 录 引言 材料与方法 材料 试验方法与温室管理 温室操作 试验数据统计与分析方法 结果与分析 V 不同基因型组合间发病情况比较 亲本及 抗病配合力分析 反交效应分析 遗传参数估计 双列杂交 问题与讨论 结论 考文献 谢 者简历 国农科院硕士学位论文 引言 1 引言 一、烟草马铃薯 Y 病毒病分布与危害 烟草马铃薯 病毒 ( 简称 起的，又称“脉带病” ,“脉坏死病”等 ,在世界各烟区均有发生 975，给世界烟草生产带来巨大损失 972； r et 1980； et 1982； 1978。在我国也广泛存在，陈 瑞泰 在山东烟区临朐城关一带首次发现 19896 个省份的调查表明 陈瑞泰等 ,1997：辽宁、黑龙江、山东、河南、陕西、安徽、广东、福建、湖南、云南、贵州和四川等 12 个省 (区 )均有发生 ,在山东、河南、辽宁和四川烟区为害较重。到 1996 年度已扩大到 15个省区 ,除以上省（区）外在河北和甘肃也有发生并且非常严重。 烟草 产、质 影响较大， 出，烟草感染 ， 每公顷产值 减少 11平均减少 36%，产量减少 7平均减少 32%，等级指数降低 36平均减少 44%。而且 接种时间越早减产越大 1978。 单独侵染外，常与 合侵染 陈瑞泰等 ,1997，对烟叶产、质影响更大。目前该病已成为全国烟草主要病害之一，给烟叶生产造成了巨大损失。 二、烟草马铃薯 Y 病毒株系研究 人们一般将 个株系 (或株系组 ) et 1982。即 :草脉坏死株系 ,通株系 ,刻条纹株系。 在研究了获自美国东南部烟草上的 个株系 et 973。 et 986； 1990在南非烟 区采集到 72个分离物 ,通过它们在不同烟草品种上的反应划分为 4个株系 ,即 坏死株系 )、 本的学者研究表明 ,日本主要有 2 个株系 ,即普通株系 (坏死株系 (其中坏死株系又被分为 3个株系 ,即 元华 吴元华， 1992鉴定我国东北烟区烟草上发生的 个株系 ,即普通株系 (脉坏死株系 (茎坏死株系 (点刻条纹株系 (1996年青州烟草研究所 王劲波等 ， 1998鉴定山东烟区主要有 2个株系 ,即 山东农业大学在山东 滕 州等地发现的烟草黄色斑驳坏死病是 谢成颂等， 1993。 实际上 如 1981年 系 , 0 多个病毒分离物后将其划分为 6 个株系 . et 1995， 同株系在一系列土豆上的症状表现划分为 个株系 ， 1995。等等。在寄主与病原相互作用中，并且随着抗病品种等的应用，新的株系将会不断出现。 中国农科院硕士学位论文 引言 2 三、烟草马铃薯 Y 病毒 抗源 烟草抗性是指烟草本身对病原物危害的抵御能力，是烟草植株阻止病原物侵入和在组织内持续增长的程度。抗性是植物的属性之一，不同植物的抗性差异从本质上是基因型不同的反映，是植物与病原物互作及环境条件互作的结果。植物的抗病性与其它性状相比有其特殊性，即它不仅决定于植物本身的基因型，还取决于病原物基因型，因此，植物与病原物互作的遗传基础即构成了植物抗病的遗传基础。植物对病原物的 抗性机制包括结构抗性、生理生化抗性、分子抗性。烟草在与病原物的协同进化中形成了各具特色的抗病机制。不同品种对 道 . 引起严重的危害和坏死 J.， 1955。 1957 年 报道 N. N. N. N. 对于 N. N. 源不同有关 )。 O. 1958 报道 N. N. N. 不感病的。 995)对 54个栽培品种、 7个烟草种及 4个体细胞杂交系进行了 54个栽培品种中发现 高抗 它品种均属感病品种。日本烟草株式会社出版的烟草属 植物图鉴中列出了抗 4个种。 陈荣平 对 29份材料进行了调查 ，发现 病毒 ，其它几个常规品种均感病 陈荣平 等， 2000。在自然界中存在着许多对 2 个种的抗病性表明 R. C， 1972，除以上的烟草种外 ,还有 N. N. N. N. N, N. N. N. 8个种对 0多个烟草种对 株系 (反应 . G., et 1982,对 3株系均表现免疫的有 : N. N. N. N. 可被 1个或几个株系侵染但不表现矮化及叶和脉坏死的有 : N. N. N, N. N. 在该研究中对种间杂交种 4n(N. 2n(N. 的抗病性也进行了研究 ,个株系都能侵染这两个杂交种 ,但不表现矮化、脉带和组织坏死病状，表明烟草野生种的抗性是可以利用的。然而，到目前为止，由于遗传的复杂性，这些抗源还没有得到很好的利用。 四、烟草马铃薯 Y 病毒抗性 遗传研究 在 性遗传研究方面， G， 1961利用辐射育种发现了抗 称 号为 其抗性受一隐性基因“ 制 ,该基因的纯合系对 特别是 系 )和 1985年发现雪茄烟品种 07 具有与 但不象 肋烟品种 505E 和 有抗 其抗性基因与 于 1991年从 品种抗能使 死的 其抗性基因为半显性基因，与 两抗性基因可以整合到一起 ,同时具有这两个基因的基因型将对 引言 3 株系具有抗性。 早确定 抗 上 973。日本对 703个烟草品种 (品系 )对 发现了 74个烟草品种 (品系 )抗 高抗品种 ,中抗品种 ,低抗品种 行遗传分析表明 ,这 5个抗源的抗病性均被 1个隐性抗病基因控制着 ,它们分别是 ), 在抗性获得的研究中， 等认为，含有 因烟草植株抗性的获得是由于 控制着对 989认为 运动中。 0%，这证明对 们分离了自然生成的抗性丧失突变体，并通过比较突变体和原先植株中氨基酸顺序，发现在病毒连锁基因蛋白（ 区域一个单一氨基酸被取代，这一区域与 抗性丧失有关。 M 认为 含量与烟草寄主抗性是一线性关系，这种关系由在感病、耐病和抗病植株中病毒 一关系的发现能够在基因放大和育种工作中量化对病毒抗性水平。 但 ,抗某一株系的品种 (系 )对其它株系是感病的 ,对 一特性被用来在室内筛选对根结线虫病的抗性品系 ,对 些株系的感病性与霜霉病的抗病性也是连在一起的。抗某些株系的品种不抗其它的株系 ,并且应用这些抗病品种后新的株系会经常产生。以上这些问题给 另外，有关抗病 品种的抗性丧失也是我们应注意的问题。据 察，在 上机械接种 病植株数量分别为 0/993和 31/873。在无症状植株中未检测到病毒或病毒 后来，病毒后代能够克服 致 100%的发病率。在感病的 生质中 制不同。尽管 原生质印迹试验（ 证明在 的一个原因。然而，当用高浓度的病毒接种完整叶片时， 能在 生质印迹试验证明了壳体蛋白围绕核心的定位环的存在。但现在还不能解释这种现象。在接种整叶片中， 显的复制的很好，但与在 片中复制不一样。在时间走向（ 研究中，感病细胞数量的增加显示病毒在植株中扩展是以细胞到细胞 (式进行的。对完 整叶片和原生质研究证明 生质在分离过程中生理学上的变化可能影响病毒复制量。以前的试验证实抗性机制在复制和细胞运动中起作用，这种抗性机制也可能影响 的复制，导致产生高的突变率和经常性产生抗性丧失分离体。以上原因给 病育种工作带来了困难 五、立题依据与意义 从以上分析可以看出烟草马铃薯 Y 病毒病（ 世界范围内烟草一重要病害，每年给烟草生产带来巨大损失。在目前缺少有效的防治药剂的情况下，种植抗病品种是防治 、最有效的防治措施。然而，当前国内烟叶生产中尚没有高抗 烟草栽培品种 王凤龙等， 1998。以前的研究多集中于 害、株系鉴定、抗源的筛选、抗性基因的定位和抗中国农科院硕士学位论文 引言 4 性形成机制等方面，缺少对抗病品种配合力分析以及抗性遗传机制等方面的研究。为深入研究烟草 速 002 年 2004 年在中国农科院烟草所进行了如下试验：本试验是在现有研究基础上，选用几个抗耐病品种和几个感病品种进行双列杂交，利用国内 作为毒源，力求探讨烟草对 算遗传模型和遗传方差，为 中国农科院硕士学位论文 材料与方法 5 1 材料与方法 材料 供试品种 表 1； 2003 年参试品种情况 003 编号 品种 抗性评价 原产地 烟草类型 1 德国 烤烟 2 美国 白肋烟 3 美国 烤烟 4 德国 烤烟 5 法国 烤烟 6 美国 烤烟 表 2： 2004 年参试品种情况 004 编号 品种 抗性评价 原产地 烟草类型 1 德国 烤烟 2 美国 白肋烟 3 美国 烤烟 4 德国 烤烟 5 美国 烤烟 供试病毒株系 在青州烟草研究所从大田分离提纯得到 提纯后接种易感植株，并置 40 筛目防虫纱网笼 中，备 用。 中国农科院硕士学位论文 材料与方法 6 杂交组合种子的获得 在烟草所试验地，选取表现正常的参试品种， 7月 份按完全 双列杂交 方法 杂交 ， 9月份收到 P（ 个杂交种和 试验方法与温室管理 温室设计 试验用温室按植物病毒研究用温室设计的要求进行设计 田波等， 1987，与饲养昆虫和用昆虫传毒的温室分开。温室内分成几个小间，以防混杂。 密封温室中一切与外界接触的地方，玻璃方框架内密封接头处。在所有出入和通气处（门、窗、天窗和温室度调节设备管道的出入口等）安装 40 筛目纱网 。在温室进出口以内设置第二道防虫纱门。 温室地面为水泥地 ，以防杂草和昆虫滋生，温室内结构采用易于消毒和清洗的钢架结构。 搞好温室内卫生管理，使病毒不致因传染而混杂 试验开始前首先对温室利用溴甲烷进行熏蒸，清除温室内病原物。 引入温室的植株和播种材料先在消毒室内用杀虫剂和杀螨剂消毒再引入温室。对进入温室人员的外衣进行除虫处理。为了维持无虫，温室内定期喷射杀虫剂 温室内所用营养土、土壤、托盘以及其它器具经熏蒸消毒后使用。 操作人员在温室内操作前，先 用磷酸皂 （配制方法如下） 洗手再进行 操作。除 间 苗、托盘假植和接种外禁止用手等可能带毒的器具接触烟叶，假植时，假植完一盘 用磷酸皂 洗一次手。温室内严禁吸烟。 为防止病毒污染，试验用烟苗单独在一间温室内培养。 温室操作 按 70草炭土 +30地表土 比例配制基质，经熏蒸消毒后使用。 育苗 按照常规育苗 方法 配制营养土，并将苗床营养土消毒后 装于 25 25洇足水、播种，每个亲本和每个 2003年 36 盘， 2004年 25 盘。 待出苗后及时做好间 苗、 定苗和苗床管理工作。 温度控制 与水分管理 中国农科院硕士学位论文 材料与方法 7 控制温室内温度，及时浇水，保持温室内一定的湿度。 托盘假植 盘 将配制好的基质与 20）的育苗专用肥 ,按 /千克混匀 ,喷水湿润后填装到托盘内 ,轻拍使其踏实。 托盘假植 当母床烟苗长至 2 片真叶时，开始假植。每盘假植一个品种， 30棵以上，每一个亲本和每一个 盘（重复 3次）， 2003年共假植 108盘， 2004年 75盘。假植前操作人员先用磷酸肥皂洗手。 病毒接种 当烟苗长至大十字（ 4片 真叶）时，取病原植株上具有 症状典型的病叶 ， 剪碎置研钵中，加适量的磷酸缓冲液 （ 磷酸缓冲液 配制方法如下） ，研磨成泥浆状，用双层纱布滤出汁液，作为接种用病毒汁液。用磷酸皂 （配制方法如下） 洗手并用清水冲净， 在每盘烟苗每株上用 400 600筛目金刚砂 接种 ， 方法： 在每株上选已展开的生长正常的两片叶，先在叶正面撒少许金刚砂，左手托叶背，右手食指沾病毒汁液在叶面轻轻往返摩擦 4次，立即用洗瓶内的清水冲洗。 每次接种保持接种力度和深度一致。 磷酸缓冲液配方 及配制方法 为： 2H 2O 蒸馏水 1000制方法为两种药品分别溶于水后，加足量水混和。 磷酸皂制备，配方为：洗衣肥皂 20份， 份，水 100份。制备方法为，先将洗衣皂切成薄片，溶解在沸水中，然后加入磷酸钠，全部溶解搅匀呈糊状，放在定型容器内 ， 使其自然干固备用 。 发病情况调查 待接种烟苗充分发病后按以下标准调查每一盘内每一株发病情况，并做好记录，计算病情指数。 级标准 0 级：全株无病； 1 级：心叶脉明或轻微花叶，或上部三分之一叶片花叶但 不变形，植株无明显矮化； 2 级：三分之一至二分之一叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，植株矮化为正常株高的三分之二以上； 3级：二分之一至三分之二叶片花叶、或变形或主侧脉坏死，或植株矮化为正常株高的三分之二至二分之一； 4级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，病株矮化为正常植株高度的二分之一以上至三分之一。 病情指数计算公式 病情指数 =（各级病株或病叶数该病级数） 100/（调查总株或叶数最高级数） 中国农科院硕士学位论文 材料与方法 8 验数据统计与分析方法 一般配合力和特殊配合力按照 ）方法 刘来福， 1984，利用 回归和遗传参数估计按 刘来福， 1984，采用烟草所王志德编制程序进行分析。中国农科院硕士学位论文 结果与分析 9 2 结果与分析 不同基因型组合间发病情况比较 2003 年参试亲本之间抗病性差异显著性检验 从表 3 表 6分析结果可看出， 2003年参试各亲本的抗病性状都能稳定的表现出来，不同亲本之间对 性存在极显著差异。 病性较强， 病性较强。感病品种和抗病品种病情指数存在极显著差异，感病品种中 病性在 5%水平上显著， 病性在 1%水平上显著。抗病品种间差异不显著。 2003年 P= 表 3： 2003 年各组合病情指数双向列表 of of 003 亲本 326 326 4： 2003 年各亲本病情指数方差分析表 of 003 变异来源 平方和 自由度 均 方 F 值 显著水平 处理间 理内 2 总变异 7 中国农科院硕士学位论文 结果与分析 10 表 5、 2003 年 各组合方差分析 1of 003 变异来源 自由度 平方和 均方 F 显著水平 组合间 29 差 60 总变异 89 表 6： 2003 年各亲本病情指数 多重比较 of 003 编号 处理 均值 5%显著水平 1%极显著水平 6 a A 3 b b c c D 1 c D 2004 年参试亲本之间抗病性差异显著性检验 表 7： 2004 年各组合病情指数双向列表 of of 004 亲本 326 326 国农科院硕士学位论文 结果与分析 11 表 8： 2004 年 5 个 亲本病情指数方差分析表 004 变异来源 平方和 自由度 均 方 F 值 显著水平 处理间 理内 0 总变异 4 表 9： 2004 年各亲本病情指数 多重比较 of 004 编号 处理 均值 5%显著水平 1%极显著水平 5 a A 3 6.1 a A 1 a A 4 b B 2 c C 表 10、 2004 年 各组合方差分析 0 1of 004 变异来源 平方和 自由度 均 方 F 值 显著水平 处理间 9 理内 0 总变异 9 从表 7 表 10可看出，同 2003年一样， 2004 年 5个参试品种的抗病性均能稳定表现出来，亲本间、 各组合之间存在极显著差异， 5个亲本中， 次 326抗病性最差，其次 病品种 情指数差异不显著，抗病品种 果与以前结论基本相同。 中国农科院硕士学位论文 结果与分析 12 亲本及 基因型之间差异显著性检验 从 2003年和 2004 年两年亲本和 表 11、表 12)可以看出，各组合对 P= 2003 年 F 值等于 2003 年 F 值等于 明供试材料间的遗传基础存在显著差异，两年结果基本一致，因此有必要做进一步的遗传分析。 表 11： 2003 年各组合 1001 00 of 003 变异来源 自由度 平方和 均方 显著水平 区组 2 处理 35 差 70 总的 107 表 12： 2004 年各组合 1002 00 of 004 变异来源