【毕业学位论文】（Word原稿）ERF转录因子LeERF2、JERF2在非生物胁迫应答中的功能分析生物化学与分子生物学硕士论文

中国农业科学院硕士学位论文 I 密级： 论文编号 ： 中国农业科学院 学位论文 录因子 非生物胁迫应答中的功能分析 o. 国农业科学院硕士学位论文 要 基因表达调控是植物胁迫应答的重要环节。植物激素和转录因子对植物胁迫应答中的基因表达调控起着关键性的作用。 转录因子是植物特有的一个转录因子大家族，它们都具有一 个保守的 合域 转录因子可调节植物对病原物、低温、干旱、高盐及伤害等生物与非生物胁迫的适应性应答，在植物胁迫应答中起着重要的作用。乙烯是植物体内一种多功能植物激素。早期研究表明 ,在植物的生物胁迫应答中乙烯可以通过 录因子调节大量含有 因表达，提高植物对生物胁迫的抗 /耐性 , 在植物的生物胁迫应答中发挥着重要的作用。近几年的研究表明乙烯也可以通过 录因子参与植物的非生物胁迫应答，提高植物的非生物胁迫耐性。本实验室以 用酵母单杂交系统从番茄 达文库中筛选到两个新基因 究表明它们都属于 转录因子，并参与乙烯和植物的非生物胁迫应答。本实验是在我们实验室原有的研究基础上进一步研究了 分析它们可能参与的调控途径。 凝胶阻滞实验（又称 果表明 白具有结合 不能同 联元件 合。转 因烟草的交结果表明 超表达除了导致转基因烟草中含有 基因 组成型表达外，某些含有 式作用元件的基因 组成型表达。但另外一些含有 基因如 含有 基因表达则不受影响。分别用 露醇和葡萄糖处理野生型和 基因烟草种子时发现 高了转基因烟草种子的胁迫耐性。低温处理转基因烟草时，高了转基因烟草植株的耐冻性。用 理烟草植株八小时并恢复生长两天，野生型烟草的死亡 率达到 而转基因植株仅为 17%。此外 提高转基因烟草幼苗根的盐胁迫耐性。这些结果表明 因可能通过调节某些含有 式作用元件的基因的表达参与植物的非生物胁迫应答，提高了植物的非生物胁迫耐性。 对 研究表明 高了转基因烟草种子对 甘露醇的胁迫耐性，而中国农业科学院硕士学位论文 理转基因烟草种子时发现 功能没有明显的影响。对转基因烟草植株的研究表明 高了转基因植株提对 理下的渗透胁迫的耐性，也显著提高了转基因烟 草对 胁迫耐性。转基因烟草的 交结果表明 超表达可造成某些含有 对含有 含有 式作用元件的基因 些结果表明 能通过调节某些含有 基因的表达而提高了植物的非生物胁迫耐性。另外 基因烟草的乙烯三重反应实验表明 与植物体内的其它功能。以上实验结果证明 与植物非生物胁迫应答，提高植物对非生物胁迫的耐性。表明了 转录因子在植物胁迫应答中具有重要作用。 关键词 ：非生物胁迫，乙烯， 国农业科学院硕士学位论文 t is to of to an on of a NA to of as to a is to RF a on to of is an a of on T is to to by of R RF T on to of RF of by of to RF is to in to of on of of to RT in We in of RT in as in no on in of by of is 0% of 6 is 7%. of of of we of by of RT in of of of EG of of in in to RT in we 国农业科学院硕士学位论文 V of on T. in to of of 国农业科学院硕士学位论文 目录 第一章 前言 . 1 究的目的和意义 . 1 . 1 种植物胁迫应答激素、转录因子和顺式作用 元件在植物胁迫应答中的作用 . 1 . 4 烯和 录因子在植物胁迫应答中的研究进展 . 5 . 5 . 7 烯和 录因子在植物胁迫应答中的功能 . 9 究内容和方法 . 11 . 11 . 12 第二章 . 13 第一 节 转基因烟草非生物胁迫应答中的功能 . 13 料 . 13 . 13 . 13 用溶液配制 . 13 的配置 . 13 . 13 验方法 . 13 . 13 迫条件下萌发的实验方案 . 14 件下萌发的实验方案 . 14 条件下萌发的实验方案 . 14 . 14 . 14 果分析 . 15 迫条件下萌发的实验结果 . 15 因烟草在渗透胁迫 （ 条件下萌发的实验结果 . 15 件下萌发的实验结果 . 16 . 17 . 17 . 18 第二节 原核表达及其 合特性的分析 . 19 料与方法 . 19 验材料 . 19 及试剂 . 19 中国农业科学院硕士学位论文 . 19 用溶液配制 . 19 . 19 般溶液的配制 . 20 验试剂配制 . 20 验方法 . 21 质 粒 . 21 . 21 质粒载体上扩增所需目的片段（ 50 . 21 . 22 脂糖凝胶中 段的回收 . 23 肠杆菌感受态细胞的制备 . 23 . 24 组子 . 24 . 24 鉴定正确的 . 25 . 25 白的原核诱导表达及纯化 . 25 白电泳迁移率实验 . 27 果与分析 . 29 . 29 化 了 . 29 . 30 验结果 . 31 第三节 交分析 下游基因表达的调控作用 . 32 料 . 32 . 32 . 32 . 32 用溶液配制 . 32 验方法 . 33 . 33 . 33 . 34 交 . 34 果与分析 . 36 结 . 37 第三章 植物非生物胁迫应答中的功能分析 . 38 第一节 植物非生物胁迫应答中的功能 . 38 料 . 38 实验材料 . 38 中国农业科学院硕士学位论文 . 38 用溶液配制 . 38 验方法 . 38 . 38 迫条件下的萌发实验方案 . 38 件下的萌发实验方案 . 39 . 39 . 39 . 39 烟草三重反应实验方法 . 39 验结果与分析 . 40 迫条件下萌发的实验结果 . 40 . 41 . 41 . 42 . 43 . 43 第二节 交分析 下游基因表达的调控作用 . 44 料 . 44 . 44 . 44 用溶液配制 . 44 验方法 . 44 . 44 . 44 . 44 交 . 44 验结果与分析 . 45 结 . 45 讨论 . 47 结论 考文献 . 50 致 谢 . 56 作者简介 . 57 中国农业科学院硕士学位论文 缩 略 词 表 英文缩写 英文名称 中文名称 脱落酸 BA 落酸应答元件 性亮氨酸拉链 合因子 补 椰菜花叶病毒 温调控 嘧啶重复序列 旱应答元件 旱应答元件结合蛋白 化乙锭 二胺四乙酸 胶电 泳迁移改变实验 烯应答元件 烯应答元件结合蛋白 烯应答元件结合因子 ET 烯 敏反应 丙基 硫代半乳糖苷 JA 莉酸 A- 莉酸激发子应答元件 莉素乙烯应答元件结合因子 那霉素 养基 莉酸甲酯 中国农业科学院硕士学位论文 X -(-( S 盐 密度 酯酰 构域 合酶链式反应 程相关 作蛋白 rd to 旱应答 分钟转速 杨酸 统获得性抗性 杨酸应答元件 1,3羟甲基氨基甲烷 烟草胁迫诱导基因 1 43 中国农业科学院硕士学位论文 前言 1 第一章 前言 究的目的和意义 境胁迫与植物的胁迫应答 植物生长在特定的环境条件下，外界环境条件的变化不同程度影响着植物生长发 育过程及状态。植物对生长环境的依赖性同植物生长环境条件的动态性，要求植物迅速应答和有效适应外界环境条件的改变。在长期进化选择的过程中，植物形成了一整套比较完善的适应外界环境条件变化的信号感受、转导和应答机制。植物对环境条件的适应是多方面多层次的。一方面，植物在组织、形态结构和生长发育等方面高度适应适应生长环境；另一方面，植物通过基因的表达调控适应外界环境条件的波动。植物激素作为植物生长发育的调节物质，在植物的生长发育调节和胁迫应答中起着重要的作用。植物在受到某一环境因素的胁迫时会合成一种或几种特异的植物激素 ，并通过这些植物激素调节相关基因的表达，改变植物的代谢方式，甚至调控植物的发育进程以适应外界环境条件。乙烯（ 脱落酸（ 水杨酸（ 茉莉素（ 植物激素在植物的胁迫应答中都起着重要的作用 (1997； et 2000； et 2000；Yu et 2001； et 2002； 2002； 2003)。基因的表达调控在 植物的胁迫应答中起着同样重要的作用。植物通过特异基因的迅速激活或钝化，可以适时、灵敏、经济有效的适应环境胁迫。植物中存在大量胁迫相关的基因，其中转录因子又起关键性作用的基因。一个转录因子可以特异的调控多个胁迫相关的下游基因的表达，这样植物转录因子就可以灵敏，有效的调节大量胁迫相关基因的表达，适应外界胁迫条件。植物含有许多转录因子，如拟南芥基因组中含有大约 1500个转录因子 （ et 2000） 。这些转录因子形成多个转录因子家族，其中同植物胁迫相关的转录因子家族主要有三个： et 2000； et 2001； et 2002）。这些转录因子通过调节植物体内大量下游功能基因如 因、 以提高植物胁迫耐性（ et 1993； 余叔文等， 1998； et 1999） 。虽然这些下游功能基因可通过一条或几条相同或不同的信号途径参与植物的胁迫应答，但其中绝大 部分是通过植物激素和 /或相关转录因子完成其胁迫应答的。植物通过激素、转录调控因子（如转录因子）、下游功能基因协同作用有效地完成胁迫应答反应。 种植物胁迫应答激素、转录因子和顺式作用元件在植物胁迫应答中的作用 茉莉酸（ 其衍生物是一类新型植物激素 ,它们结构上的特点是具有环戊烷酮 ,统称为茉莉素（ 茉莉素功能广泛，与植物的多种生理功能相关，如：抑制光合作用；促进呼吸作用，气孔关闭；叶片衰老脱落以及果实成熟；伤害、机械压力、病原物侵入以及渗透胁迫等 (余叔文等 ,1998)。茉莉素能调节许多基因的表达，诱导产生多种蛋白，特别是植物防御和胁迫蛋白的表达。对拟南芥 失型突变体的研究也证明茉莉素参入调控植物整体抗性，包括抗虫性、抗病性、抗伤害以及抗干旱 (et 1997； et 1998)。中国农业科学院硕士学位论文 前言 2 水杨酸（ 样也参与调节植物体内的多种生理生化过程，如植物开花、种子发芽、气孔关闭、膜通透性及离子的吸收等，是一种新的植物内源激素 ( et 1994)。 近来又发现加速被侵染部位细胞的死亡、诱导系统抗性产生、诱导某些抗性基因及抗性相关蛋白的表达、影响植株的某些抗性生理反应等等，能诱导植物提高抗病性产生抗盐性状，还可提高植物抗脱水能力及抗瘟性（ et 2000； et 2002）。脱落酸（ 调节植物生长发育的一种多功能激素。它参与植物胚胎发育、种子休眠、果实成熟以及逆境胁迫应答，如抗脱水、干旱、高盐、低温及抗病虫害和机械损伤等多方面生理功能 (et 1994; et 1992; et 1994)。 为它同种子休眠，叶子衰老脱落有关。后来研究发现 植物的非生物胁迫中起着更重要的作用，它可以通过et 1998） 。乙烯作为一种气体植物激素参与植物众多的发育调控和适应性应答，包括种子的萌发、花和果实的凋亡，叶片的脱落，果实的成熟，根瘤的形成，细胞的程序性死亡，对病原物侵入及低温、干旱、盐 碱及伤害等生物和非生物胁迫的应答 （ et 1998, 000）。乙烯在植物胁迫应答中的作用最初主要集中研究其对植物抗病性的影响 （ et 1998； et 1999； et 2002） 。近几年随着研究的深入，人们发现乙烯在植物的非生物胁迫，特别是对植物的低温、盐碱耐性方面同样起着重要的作用 （ Yu et 2001, et 2002） 。目前关于乙烯在植物体 内信号转导途径的研究取得了长足的进展。通过对拟南芥大量乙烯突变体的研究，人们对乙烯细胞内主要的信号转导途径和机制已经有了相当的认识，乙烯信号传导途径上的许多重要成分已经被克隆和详细研究 （ 2004） 。但乙烯在非生物胁迫应答中的分子机理研究较少，对乙烯在非生物胁迫应答机制的阐述也还不够清楚。在乙烯和非生物胁迫的关系上仍然有大量问题有待研究和阐明，主要表现在：乙烯同其它信号途径如植物激素 光，温，代谢调节等信号途径之间相互关系还不很明了；另外，虽然研究表明许多 逆境比如低温，干旱，高盐，病原物均能诱导乙烯的生成，研究也表明胁迫下许多乙烯相关的功能蛋白被诱导表达，但对乙烯生成和功能基因表达之间关系的研究不多也不十分清楚；此外胁迫条件下乙烯诱导表达的功能基因与乙烯在植物形态发育方面的功能之间的相关性引起越来越多的关注（ Yu et 2001）。 生物在生长发育过程中受遗传信息和环境信息的共同调控，要求对各种功能基因的表达进行精确调控，协调完成对内外环境条件的应答。植物能感受各种外界环境刺激，并通过一系列信号转导激发反式作用因子，而反式作用因子与顺式作用组件结合 后，又激活 合酶转录复合物，从而启动基因的转录表达，这些基因产物行使不同的功能，最终完成植物对外界信号在生理生化等方面的胁迫应答反应。在植物的胁迫应答中不同的胁迫信号可以通过多信号途径的相互作用形成一个迅速、有效、协调的信号网络来调节植物的胁迫应答。在这个过程中转录因子与顺式作用组件的识别起到重要的作用 (2001； 2003； 2003)。转录因子也称为反式作用因子，是能够与基因启动子区域 中顺式作用组件发生特异性相互作用的 过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制基因转录。通过这种方式，转录因子可以同时调控大量相关下游基因的表达，使植物迅速地适应环境条件的变化，并通过与顺式作用组件的特异性识别，调控特异的基因表达，协调植物与环境的关系。所以转录因子和顺式组件协调作用可以灵敏、高效、特异的完成植物胁迫应