【毕业学位论文】（Word原稿）抗稻瘟病和白叶枯病杂交水稻分子标记辅助选择研究作物遗传育种硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 抗稻瘟病和白叶枯病杂交水稻分子标记辅助选择研究 录 摘 要 . . 文缩略表 . 一章 文献综述 . 1 国水稻生产及其主要病害概况 . 1 育抗病新品种是解决病害的有效途径 . 1 稻抗病育种基础理论研究进展 . 1 稻抗病育种的新战略与新技术 . 2 稻病原菌与抗病品种互作体系研究 . 3 稻病原菌分布与遗传多样性 . 4 稻对稻瘟病与白叶枯病抗性的分子生物学研究 . 4 稻抗病基因的发掘与研究 . 5 稻抗病基因的遗传研究与定位 . 5 稻抗病基因的精细定位与克隆 . 7 稻瘟病基因精细定位与克隆 . 8 白叶枯病基因精细定位与克隆 . 9 稻分子标记辅助选择 . 10 子标记的类型 . 11 稻抗病分子标记辅助选择研究进展 . 13 第二章 抗稻瘟病分子标记辅助选择研究 . 18 料与方法 . 18 料 . 18 子标记 分析 . 18 稻瘟病基因 t)和育性恢复基因检测 . 19 据分析 . 22 瘟病抗性鉴 定 . 22 带有恢复基因的株系恢复性验证 . 22 果与分析 . 23 稻瘟病基因 t) 和 t)的定位 . 23 对抗稻瘟病基因 t)的群体基因型分析 . 23 t)基因纯合株系恢复基因的分子标记检测 . 24 瘟病抗性表型筛选与标记辅助选择效率分析 . 26 复力鉴定和产量比较 . 26 论 . 29 第三章 抗白叶枯病分子标记辅助选择研究 . 30 料和方法 . 30 料 . 30 白叶枯病基因分子标记检测 . 30 叶枯病接种 . 31 果分析 . 31 叶枯病抗性基因 分子标记辅助选择 . 31 体亲本及基因累加系的白叶枯病抗性鉴定 . 33 子标记辅助选择的效率 . 35 论 . 36 第四章 稻瘟病抗性基因 )和水稻白叶枯病抗性基因 聚合研究 . 38 料和方法 . 38 料 . 38 病基因连锁标记的选用 . 38 病基因的聚合筛选方法 . 38 果与分析 . 40 瘟病抗性表型筛选 . 40 病基因分子标记辅助选择 . 40 加系白叶枯病抗性鉴定 . 40 论 . 43 参考文献 . 44 致 谢 . 54 作 者 简 历 . 55 要 用分子标记辅助选择（ 法培育抗病品种是 水稻生产中 经济有效的防病措施，而且是水稻高产、优质、多抗综合育种目标的重要组成部分，具有重大的实践意义。 在 t)基因定位基础上，进一步筛选位于 t)基因所在区间的 14 个 记，并将其中的 4 个标记 加到遗传图谱中的第 6 染色体上。 来自中 156/谷梅 2 号所衍生的 304 个重组自交系的 别与高产恢复系 3308 进行杂交配组，采用单粒传法加代传种，于 2004 年获得 6 个 体（ 于验 。选用分子标记 测 6 个 体，结合标记 筛选到 t)基因纯合的株系 109 个。用与恢复基因连锁的标记对这 109 个t)基因纯合的株系进行第二轮筛选，结果共获得 20 个既携带 有 t)抗稻瘟病基因又有恢复基因的株系。同时，挑选 3 个 体进行人工稻瘟病接种试验，以检测标记辅助选择的符合率，结果表明三个标记对三个群体的 合率不同，单个标记 合率均不高，只有 70%80%，个别标记在特定群体辅助选择的符合率仅有 如果同时使用位于 t) 基因两侧的分子标记进行辅助选择，则 率明显提高，最高达到 最低也有 可见同时使用位于目标基因两侧的标记， 合率会有较大幅度的提高。初步恢复力鉴定试验表明，通过 因的株系对印水型不育系中 9A 能恢复正常的结实水平。 由高产恢复系 3别与白叶枯病抗源供体材料 制杂交组合，用单粒传法加代传种，于 2004 年获得 3 个 群体用于 验。以 记 别对抗白叶枯病基因 进行标记辅助选择。每个群体均将 为第一轮选择对象，获得含有 植株后再进行 果从三个 群体 203 个 株 系 中 选 到 了 41 个 多 基因 累 加 系 ， 其 中（ 2 个系，（ 7 个系，（ 1 个系，（ 3 个系，（ 25 个系，（ 5 个系。选用 6 个使亲本间呈现良好抗感反应的白叶枯病代表菌系进行人工接种试验，结果表明在双基因累加系中， 抗性强于 抗性，说明隐性抗病基因是两个优良的白叶枯抗性基因；三基因累加系的抗性水平强于双基因累加系。选用 2 个群体（ 行人工白叶枯病接种试验，以评估 3 个标记的 合率，结果表明 群体 均符合率分别为 标记组合 选择效率有所提高，在两个群体中的平均选择效率分别为 根据 择结果，分别挑选 5 个抗白叶枯病多基因累加系与 5 个带有 抗稻瘟病基因的株系两两进行有性杂交，共配制 25 个杂交组合，以获得既抗白叶枯病又抗 稻瘟病的基因累加系材料。根据标记选择结果，选用 合进行 析，首先对其 体进行抗稻瘟病筛 V 选，淘汰感病植株后的群体再用各个抗性基因连锁标记进行 析。其中 t)基因用标记 时筛选， 别用 行筛选，结果获得多种类型的多基因累加系。用白叶枯病菌系 部分白叶枯病抗性基因纯合累加系进行苗期接种鉴定，结果各株系与亲本 抗性水平相当，均抗白叶枯病，而 感病，用分 子标记 白叶枯病抗性基因进行选择是可靠的。 所获得的既抗白叶枯病又抗稻瘟病的基因累加系材料既可以直接用于育种材料，也可以作为优良的抗源，去改良生产中具有强大应用潜力的感病材料，能够起到提高育种效率缩短育种年限的作用。 关键词： 水稻；白叶枯病；稻瘟病；分子标记辅助选择（ 基因聚合 is an to an of to a in on of t), 14 SR in t) of to of 81 114, 04 of 56/, as to 3308, a 1 by 004, IL at 6 A7 to 09 t) SR 7 In 20 t) of 09 to to to be . 5AS in AS of 0% 0% AS of in a AS 7%, as on of on AS of of A 3as 004, at 6 SR B to 6 to B As 41 B 6 03 B 7 1 23 25 of of of of a of to B of 5to AS of AS of AS of in a In AS of In of it be AS , AS in t) 5 of AS to be AS 2 of . 5to AS by to t) 7 B in oo 23 to to B in B be to as .), 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 子标记辅助选择 合酶链式反应 机扩增多态性 组自交系 制性片段长度多态性 单序列重复 单序列长度多态性 列特性扩增区域 列标签位点 增片段多态性分析 苷酸结合位点 亮氨酸重复子 变数目串联重复位点 切扩增序列多态性 核苷多态性 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 国水稻生产及其主要病害概况 水稻是我国播种面积最大、总产最多、单产最高的粮食品种，在粮食生产和消费中历来处于主导地位。在过去三十年中，稻谷面积占我国粮食总面积的 30左右，稻谷产量占粮食总产量的40左右，占谷物总产量的 45左右，占商品粮的 50左右。我国是世界上的稻谷生产大国，稻谷面积居世界第二位、总产居第一位。杂交水稻实现三系配套并在 生产上大面积应用，给我国水稻生产带来了新的革命；随着超级杂交稻战略计划的提出和实施，又将给水稻生产带来新的希望。然而中国加入世界贸易组织后稻米市场竞争日益激烈，又由于人们生活水平 和对环境的要求 不断提高 ， 对大米及其相关产品的要求也在不断的变化，因此如何提高水稻及其产品的综合水平已经是摆在研究者和生产者面前的重大课题。 危害水稻的侵染性病害有 300 多种，有些分布于全世界，有些局限于部分地区。在我国，常年发生的水稻病害有 29 种，其中白叶枯病和稻瘟病是严重危害水稻生产的两大主要病害。水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单 孢菌 (稻变种引起的一种细菌性维管束病害，病菌通常从水孔和伤口侵入，沿叶脉产生白色病斑，导致叶片枯萎，影响光合作用，千粒重降低，一般减产 20%30%，严重可减产 80%，甚至绝收 ( . 1997)。热带风暴和台风频繁出现的沿海地区以及暴雨和洪水常发生的长江流域，往往容易发生白叶枯病流行。 稻瘟病是由子囊菌 性世代为 引起的广泛发生在世界各稻区的最重要水稻病害之一 (， 1985)。世界水稻生产最具毁灭性的病害之一，每年都造成严重损失，已成为水稻高产稳产的主要障碍因素之一。稻瘟病菌可以侵染水稻的叶片、叶鞘和整个穗部，危害水稻生长并导致减产。 育抗病新品种是解决病害的有效途径 在水稻生产中，一般通过传统的化学防治和种植抗性品种等途径来控制病害。但是化学防治既昂贵又缺乏长期有效的杀菌剂，且污染环境又影响稻米质量。随着人民生活水平和质量的提高，对绿色、优质稻米的需求量日益增加，生物农药因其较小的环境污染正 越来越引起植物病理学家们的关注。由于病原菌小种遗传的复杂性和致病性的多样性，抗病新品种常于推广数年内很快就丧失抗性，造成大面积粮食减产。尽管如此，长期的实践表明，培育和利用抗病品种是经济、安全而且有效的措施。不同病害由于抗病育种基础理论（主要是病原菌致病性与寄住抗病性等）研究的深度和广度不同，抗病育种的进展也不尽相同。 稻抗病育种基础理论研究进展 瘟病抗病育种基础理论研究 稻瘟病菌以其高度的异质性和变异性而著称，其致病性变异与分化的结果，导致了田间生理中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 小种的多样性和复杂性。近 年来稻瘟病菌 纹分析、非致病性基因克隆，以及功能基因鉴定的研究成果揭示，稻瘟病菌在分子水平上也是高度异质和易变的，非致病性基因自发突变的频繁发生，使病原菌迅速克服新应用的抗病基因成为可能。加强病原菌致病性的变异机制研究，探讨生理小种演化的潜力将有助于利用常规的和遗传工程的手段培育持久抗病品种。 稻瘟病菌对水稻品种表现出很强的专化性，也就是说，不同水稻品种对稻瘟病菌的抗性差异非常明显，有些品种表现高度抗病或免疫有些品种则表现高度感病。利用抗病品种一向被公认为防治稻瘟病最经济而有效的措施。然而，迄今为 止国内外选育的绝大多数抗病品种普遍存在一个 “短命 ”问题，即大面积推广种植 35 年就 “丧失 ”抗病性，引起稻瘟病的爆发和流行。抗病性的 “丧失 ”与病原菌致病性的变异及水稻品种的专化抗性有关。非专化抗性虽然很少受病原菌致病性变异的影响，保持时间较久，但由于鉴定和选育都比较困难常为育种和生产上忽视。近年来非专化抗性的发掘和利用越来越受到注意。 水稻品种对稻瘟病的抗性大多受 1 对或几对主效基因控制。多数抗病基因呈显性或不完全显性，亦有呈隐性的，不同基因间相互独立或存在互作关系。除主效基因外，还涉及到微效基因的作用。杂交 后代抗性的表现及分离常因抗病基因的种类和数目、具体杂交组合以及所用鉴别菌系的不同而异。水稻对稻瘟病专化抗性的遗传率较高，可在早代进行选择；对非专化抗性的研究较少，其遗传远比专化抗性复杂。 叶枯病抗病育种基础理论研究 白叶枯病菌 不像 稻瘟病菌那样易变多变，但也存在着致病性的分化。国际水稻 研究 所（ 菲律宾曾鉴定出 9 个生理小种，我国上世纪 80 年代鉴定出 7 个小种群。在我国，白叶枯病菌优势小种的分布因生态区不同而异，其致病力从南到北呈现由强到弱的趋势。和稻瘟病一样，水稻品种对白叶枯病的抗性也 具有很强的专化性，也大多受主效基因控制，抗性的利用相对容易。不同的是，水稻品种对白叶枯病的抗性表现出明显的生育期差异，有苗期抗性、成株期抗性和全生育期抗性之分。由于白叶枯病菌本身的变异相对稀少因而抗病品种的抗性也相对比较稳定。但是，国外如菲律宾等已经发现抗病性因新致病小种的产生而丧失的 事例 ，国内也存在抗病品种长期种植后抗病性变弱的情况。水稻品种对白叶枯病抗性的遗传多数受单基因或寡基因控制。这些抗病基因表现显性或隐性、独立或互作等遗传特性，并存在微效基因的作用。如何有效地利用抗白叶枯病基因已成为水稻抗病品种选 育和应用中值得重视的问题。 稻抗病育种的新战略与新技术 稻持久抗病育种 长期以来国内外水稻抗病育种工作，主要是针对水稻品种专化抗性强的病害，例如稻瘟病和白叶枯病。抗病育种通常采用常规杂交，结合回交、复交或辐射诱变等手段选育抗病品种。由于以往的抗病育种多利用抗病亲本的主效抗病基因，所育成的抗病品种在大面积单一种植时，常因中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 病原菌致病小种的出现而发生感病化，给水稻生产造成新的损失。水稻对稻瘟病抗性的丧失问题最为严重，绝大多数抗稻瘟病品种大面积推广 35 年就发生感病化，抗白叶枯病品种大 面积推广35 年以后也往往出现抗性下降或丧失现象。选育持久抗稻瘟病、白叶枯病品种已成为水稻抗病育种的新战略。 稻细胞工程育种 水稻细胞工程是近代生物技术的一个重要组成部分，是以水稻组织和细胞离体培养与操作技术为基础的一类新育种技术 主要包括胚培养、花药培养、体细胞筛选和体细胞杂交等。以细胞工程为手段，育种家可以在细胞水平上改造水稻，力求更快更容易地培育出新品种，其中也包括打破物种间、属间甚至科间的遗传障碍，将近缘种属的有利基因导入栽培稻，进而丰富水稻的遗传基础。在远缘杂交方面， 过幼 胚培养和回交手段将小粒野生稻的抗稻瘟病基因 t)转入栽培稻，广西农科院、中国农科院等通过胚培养和花药培养将普通野生稻、疣粒野生稻的抗稻瘟病、白叶枯病基因导人栽培稻，培育出一批抗病新品系。 稻转基因育种 植物转基因技术，是利用遗传工程手段有目的地将外源基因或 建，并导人植物基因组中，通过外源基因的直接表达，或者通过对内源基因表达的调控，甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达，使植物获得新的性状的一种品种改良技术。它是基因工程、细胞工程与育种技术的有机结合而产生的一种全新的育种 技术体系。转基因技术可以将水稻基因库中不具备的各种抗性或抗性相关基因转入水稻，进一步拓宽了水稻抗病基因源，为抗病育种提供了一条新途径。近 10 年来，植物抗病毒基因工程的技术路线已趋向成熟，国内外相继开展了水稻东格鲁病、条纹叶枯病、黄矮病、矮缩病等 8 种病毒病的转基因育种研究，将各病原病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、编码结构或非结构蛋白基因、干扰素 分别导入水稻，获得了抗不同病毒病的转基因株系或植株。在抗真菌基因工程研究方面，一些与抗真菌病害有关的基因，包括各种几丁质酶基因、芪合成酶基因、核糖体灭活蛋白基 因、 葡聚糖基因、烟草渗压素类蛋白基因、洋葱抗菌蛋白基因、 因 得一批抗稻瘟病、兼抗稻瘟病和纹枯病、兼抗稻瘟病和白叶枯病的转基因株系和植株。在抗细菌基因工程研究方面，在广谱抗白叶枯病基因 克隆以后，国内外相继开展了 转基因研究，已成功地将 人到 一 批优良常规稻、杂交稻保持系和恢复系中，有望培育出能在生产上应用的抗白叶枯病的水稻品种。国内一些学者还将抗菌肽 B 和蚕抗菌肽基因转入水稻，获得了抗白叶枯病、条纹叶枯病的转基因株系或植株。 稻病原菌与抗病品种互作体系研究 病原菌与寄主互作体系研究的进一步深入为有效控制作物的抗病性带来了新的希望。人们从半个多世纪的水稻抗病育种中积累了宝贵的经验，也一直面临着对付病菌群体迅速变异和提供足以抵御多个病菌致病型