【毕业学位论文】（Word原稿）水稻标签库突变体筛选与分析生物化学与分子生物学博士论文

I 密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 水稻标签库突变体筛选与分析 .) .) 要 水稻（ .）是世界上最重要的粮食作物之一，同时也是单子叶植物和禾本科作物分子生物学研究的模式作物。目前水稻基因组序列测定工作已经基本完成，预测编码基因超过 40，000 个，但目前克隆的功能基因仅有几十个。大规模 T 签库创建将成为高通量研究水稻基因功能的主要工具。本研究主要围绕正在构建的增强子捕获系和激活标签系 两个突变体库开展工作。内容主要包括两种标签库的突变效率评估和突变体的筛选，以及建立了一套高效扩增水稻侧翼序列的方法。 以粳稻品种日本晴为转化受体建立了高效的农杆菌介导的转化体系，并利用此体系构建了近10 万份独立的 入标签系（基因激活标签系和增强子捕获标签系各 5 万份），并获得了子。对其中的部分突变体进行了初步的田间鉴定，获得有明显表型改变的突变体总共 4， 046份，突变频率为 6%，包括株高（高、矮）、生育期（早开花、晚开花）、育性（部分不育和完全不育）、叶型（宽叶、窄叶、针叶）、叶色（白化、黄化 、深绿）、分蘖力（单分蘖、少分蘖、多分蘖）、粒型大小（长粒、大粒、小粒、小胚乳、双胚）、种子颜色以及内外孚异常、模拟病斑等。另外，还筛选到一些特殊性状的突变体，如脆杆突变株系、无中脉突变体株系、穗发育受阻突变体，异时性等。 对增强子捕获标签系和激活标签系 表型变异的比较观察发现，二者具有明显表型变异的突变体分别达到 考虑到我们两个群体的构建过程一直是平行进行的，除载体不同外所有的创制条件都是相同的，推测基因激活的效率应为二者之差，即 1%，这个结果为进一步的 表型变异所验证。 利 用改进的 法，我们已经获得 1000 余条标签突变体插入位点侧翼序列，并对插入的位置进行了比较初步的分析，其中约有 53%属于有效插入（插入在基因的编码区、内含子区或启动子区）。在我们的突变体库中我们已经发现了 4 个已经被报道的基因，其表型与前人 道的表型一致。尤其花期一直被认为是数量性状，日本科学家 2000 年在 报道的克隆了花期相关的数量基因 是我们发现在获得生育期相关的突变体中，有一早熟突变体，比对照野生型日本晴提前开花两个月，插入侧 翼序列扩增与测定表明这个突变体是恰好是由于 破坏所造成的。我们现有 5 个侯选基因已经通过共分离得以确认，互补实验正在验证中。 10 个候选基因插入同一基因不同位点表型相似的。大田的跟踪调查正在同步进行当中。 通过以上分析，表明我们构建的水稻突变体库无论从容量上、突变体的数量上、标签位点的获得等方面都已初具规模，从 4 个已报道的基因来看，我们的标签突变体库是可以有效的用来进行规模化的水稻功能基因研究。 关键词 水稻，突变体表型， .) is of in a of of is 0,000 up to a to of of a of We up a 100 2 4,081 1 as of of IV in %, 0 ,000 of 3% in By in as by as a in of 5 by at As a be .), V 目 录 第一章文献综述 . 1 入突变体库和转座子插入突变体库概述 . 1 建不同 入突变体库的必要性 . 2 因敲除技术的应用和局限性 . 2 因捕获技术 . 3 活标签技术 . 4 得外源片段插入位点侧翼序列的方法 . 4 南芥和水稻插入突变体库研究进展 . 6 南芥插入突变体库研究进展 . 6 稻插入突变体库研究进展 . 6 稻突变体和基因分类及数量 . 9 养器官相关的突变体与基因 . 10 殖器官相关的突变体与基因 . 13 子发育相关的突变体和基因 . 15 时性 . 16 性和逆性 . 17 研究的目的和技术路线 . 21 研究的目的 . 21 术路线： . 21 第二章水稻 T 入突变体库和逆转座子突变体库的构建 . 23 变体库载体的选择 . 23 增强子捕获载体 . 23 活标签载体 . 23 源的逆转座子 . 24 稻 T 入突变体库的构建流程 . 24 稻饱和突变标签系大小评估 . 26 第三章水稻标签突变系表型鉴定 . 28 料与方法 . 28 期与生长期突变体的筛选 . 28 异突变体的筛选 . 28 果与分析 . 28 种 T 变标签系的表型观察 . 28 种 T 变标签系表型比较与效率分析 . 31 种 T 变标签系 . 33 要农艺性状的突变体发现 . 33 秆突变体的归类 . 36 型突变体的筛选 . 38 论 . 40 第四章 水稻突变体侧翼序列的分析 . 41 料与方法 . 41 提取和 增 . 41 翼序列的测定 . 42 翼序列的同源性比对 . 43 果与分析 . 43 增效率比较 . 43 入到水稻基因组位点比较 . 44 入水稻基因组位点分析 . 44 用标签系克隆水稻基因 . 45 论 . 46 改进对水稻高效扩增侧翼序列的探讨 . 46 水稻功能基因组研究中的比较 . 47 签系克隆水稻基因展望 . 47 第五章全文结论 . 49 参考文献 . 50 致 谢 . 59 作者简历 . 60 国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章文献综述 近十年来，双子叶模式植物拟南芥（ 单子叶模式植物水稻 （ 2000； 2000； 2001； 001； 2002； 2002； 2002； 2002）全基因组测序工作的完成，以及全长 列（ 2002； 2003）和表达序列标签（ 1999； 2002； 2003）等数据的快速增长。科研人员可以通过互联网获得大量的生物数据来揭示基因功能。生物进入了一个后基因组时代，各种类型的突变体和生物数据库结合将更快捷地揭示基因功能。利用基因敲除（ 无效突变（ 得突变体将更有价值：由于全基因组序列已知，利用侧翼序列在数据库中比对，就可以很容易地获得靶基因的序列，避免了繁琐的文库构建、筛选和测序过程。因此以模式植物为材料，建立大规模的插入突变体库（ 已经成为植物功能基因组学研究的基础。插入突变体库以基因标签技术为基础，是大量基因标签植株和标签插入位点的总称，主要包括转座子插入突变体库和 入突变体库两类。由于 入突变的优点较多，应用也更为广泛，因此本章重点讨论 入突变体库，兼顾转座子插入突变体库。 入突变体库和转座子插入突变体库概述 签技术（图 以农杆菌介导的遗传转化为基础的一种插入突变研究方法。由于农杆菌的寄主范围较广 ， 转化技术成熟 ， 是创造插入突变体的有效途径。与转座子标签技术相比 ， 该法的最大特点是插入后较稳定。在获得稳定的突变表型后 ， 可用报告基因作为探针在突变体文库中克隆相应的功能基因。若插入的片段内包括大肠杆菌的复制起点 ， 则可通过质粒挽救的方法克隆插入序列旁翼的植物基因片段。 入的另一特点是 ， 如果插入的是无 启动子的抗生素抗性等报告基因 ， 则一旦 入植物启动子附近 ， 就可导致外源报告基因的表达 ，从而在细胞或组织水平上进行筛选（ 2002）。 转座子标签法 （ 的原理是利用转座子造成基因突变 ， 以转座子序列为标记 ， 从突变株的基因文库中筛选出所要的转座子的克隆 ， 然后通过测序分离转座子旁侧的部分序列 ， 再利用这部分序列筛选野生型基因文库获得完整的基因（ 1996； 1998； 2000）。转座子标签法有两种体系：自主转座元件单 因子体系和双元转座子体系。自主转座元件单因子体系利用转座活性较高的自主转座子如玉米的 矮牵牛的 。该体系有两个优点：一是在植物中插入拷贝数高，如 件每个基因组平均拷贝数可达 100 以上，因此可以在大田自然培养条件下获得大量突变个体；二是只需筛选相对较少量的植株就能标记所有基因。然而，这一体系也存在一些问题：自主转座元件高频率的转座有可能切除转座酶而留下一些序列导致永久突变；自主转座在体细胞内可能造成基因功能自动恢复；自主元件切除留下一些片段使转座元件不能与突变表型共分离，这些都增加了筛 选克隆的困难，阻碍了转座子标签的推广。双元转座子体系由一个非自主转座元件和一个经改造的自身不能转座的自主转座元件中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 2 组成，后者仍编码转座酶，引起前者的转座。通过分别构建含两个元件的植物表达载体，转化植物可分别培育含有非自主性转座子和转座酶的株系，再通过杂交，在 就能获得大量由转座子引起的突变体。为了减少筛选子代突变体的工作量，可以在构建的转座元件上插入用于筛选的标记基因，如抗生素抗性基因、除草剂抗性基因等。随着植物遗传转化技术的成熟 ， 人们可以将异源转座子在异源植物中发生转座，从而大大拓宽了转座子标签法的应用 范围（ 1999； 003）。 以 转座子 （ 作为植物基因标签技术的插入元件 ， 在许多植物如拟南芥、金鱼草、水稻和玉米等重要基因的分离研究中已得到成功的应用（ 1997； 1998；2000； 2001； 2002； 2003）。 图 选 入突变体库的基本策略 建不同 入突变体库的必要性 因敲除技术的应用和局限性 基因敲除，又称无义突变，依靠基因被破坏后显现的表型来确定基因，是当前通过 T T 入到基因组的不同位置，效应也不同：如果插入到编码区或启动子区，则引起基因插入失活；如果插入启动子区或 3非翻议区，则引起基因的表达量降低；当插入的 T 有增强子如 35S，则会引起基因表达量升高；多点插入不同基因，引起表型 的多效性； T 会造成染色体重排。这种方法一直很有效，得到许多表型相应基因功能的突变体（ 1997）。但是，这种方法不能有效鉴别功能重叠基因中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 3 （即所谓的冗余基因）和那些在不同的发育阶段表现不同功能的基因。 许多敲除突变体没有可见的表型改变，原因是多方面的。第一，同一或其它基因家族的成员可提供相同的功能，而且许多基因在多个发育阶段有功能，这些基因的突变可导致早期致死，或者可能有多效性，它能在一个特定的代谢途径中掩盖某一基因的作用。第二，瞬间表达的基因、表达水平 很低的基因、以及在少数细胞中表达的基因，都可能难以被鉴定出来。第三，一个基因家族中的多个成员有功能上冗余。为测试这种功能重复，可将含同一基因家族不同成员突变的植株相互杂交，创建二基因突变体、三基因突变体系来研究基因功能。第四，基因家族的单个成员可能已进化到仅在特定的生理逆境状态下才有功能，为检验某一未知功能基因的表型 ， 可以采用一系列有效的生理逆境条件加以诱导。 因捕获技术 基因捕获技术是最近发展起来的方法。它的原理是依靠随机整合到基因组的报告基因（如）的表达模式来鉴别基因，并不完 全依赖于突变体的表型。这种方法对于鉴别未知基因和调控序列非常有效（ 2000）。用报告元件的表达模式来发现突变的基因，这种方法可以揭示插入功能重复的基因和在多个发育阶段均有功能的基因，这是基因敲除技术所不能比拟的。 目前已发展了三种基本类型：增强子捕获、启动子捕获和基因捕获（见图 图 强子捕获、启动子捕获及基因捕获载体结构 of 强子捕获（ 报告基因与最小启动子融合。典型的最小启动子，含 不能单独驱动报告基因的表达，若被插入位点附近的增强元件激活，则可导中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 4 致报告基因的表达。 启动子捕获（ 利用不带启动子的报告基因，随机插入基因组中，由插入位点附近基因的启动子启动报告基因表达。通过检测报告基因表达强度与表达部位，可以判断报告基因插入位点的启动子的表达模式。在拟南芥功能基因组研究中，已有很多用转座子标签和启动子活性元件 方法捕获分离拟南芥基因成功的例子。 （ 2000）试验了用无启动子的 因构建在 ，通过 随机插入来分离水稻中的启动子。 结构报告基因捕获（ 报告基因前没有任何调控元件，只有插入基因内部且方向正确，通过水稻内源基因的调控元件调节结构报告基因的表达。若插入内含子中也能正确表达，因为报告基因之前有一个或多个剪切受体序列，通过剪切可以产生上游外显子序列至报告基因的融合蛋白。依据报告基因表达模式可以判断和鉴定未知基因的功能，也可分离鉴定杂合子中的致死基因、低丰度和只 在少数细胞中表达的基因。 以上三种方法各具优点，增强子捕获不受方向、位置、距离的限制，均可通过报告基因高频率表达导致基因表达检测。启动子捕获及基因捕获则要求插在基因中且需方向正确，相比增强子捕获更可能导致基因失活。启动子捕获及基因捕获除了可以导致转录融合外，还可以导致翻译融合，提供蛋白质定位的信息。一些基因失活所产生的表型变化很不明显，容易被忽视，而基因捕获系统能够把这种微弱的变化反映为报告基因表达模式的变化，使之放大更容易被鉴定出来。有些基因捕获标签系中，报告基因的表达是组织或器官专一性的，而另一些标签系 中报告基因在很多部位都有表达。基因捕获系统中，最常用的报告基因是 因，该基因产物的检测灵敏度高，分析起来省时省力，无放射性，而且蛋白 N 端形成翻译融合后不影响酶活性。 析的缺点是不能进行活体观察，材料经染色处理后即不可逆的被破坏。来源于水母（ 绿色荧光蛋白（ 因作为报告基因有诸多优点：可以进行活体观察，检测方法比 简单，不需要检测试剂，可用于细胞内 基因表达的评估和融合蛋白的定位等，因此其应用日益广泛（ 2003）。 活标签技术 激活标签（ 术的主要原理是使插入位点基因的过量表达或异位时空表达，导致基因的显性功能获得性突变。这种方法特别适用生理诱导表达、弱表达、致死突变、冗余基因的功能获得。具体做法是在 T 左边界或右边界携带有多聚的花椰菜花叶病毒强子。迄今已经成功地用于鉴定生长素、细胞分裂素的自养生物，同时也用于植物多胺代谢突变体的鉴定。在拟南芥中，已通过 T 活标签法分离鉴定出 基因。 （ 2000）通过 活标签群体分析，鉴定了 30 个不同表型的显性突变体， 明插入位点附近的基因过量表达。 除了增强基因表达，激活标签还具有普通标签的特点，插入基因内部时，引起插入突变。如果激活标签反向插入到基因上游，有时会通过反义表达造成基因沉默。多种功能合而为一，大大提高了激活标签标记基因的效率。 得外源片段插入位点侧翼序列的方 法 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 5 在构建大规模的突变体库后，筛选突变体和扩增插入位点的侧翼序列是两个重要瓶颈。扩增侧翼序列的方法有许多： 离法、 离法、反向 热不对称交错 离法、质粒挽救（ 中 率相对要高一点，应用较为广泛。 热不对称交错 该方法是扩增与已知列邻接的未知侧翼序列的有效技术（ 1995）。最初用于 体克隆基因的分离，后又用于标签基因的分离，取得了成功。其基本原理是利用多个嵌套的特异性引物和一个短的兼并引物（ 合，以突变体基因组 摸板，进行多次应。特异性引物的 一般在 57而随机兼并引物的 则为 44采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，获得插入侧翼区特异性扩增片段。 离法可降低非特异产物的背景，同时可产生 2 个以上嵌套的目的片段。 （ 2004）报道用 增水稻获得了成功，获得 500 余条 入片段的侧翼序列。 质粒挽救（ 若 设有可在大肠杆菌中复制的复制子，可直接利用酶切突变体 连接酶环化 转化细菌 筛选出 隆的方法来获得侧翼序列，由 于选择的内切酶至少有一个切点在 的水稻基因组 ，所以选出的 隆上带有植物 段。在质粒载体的 、右边界内设计加入大肠杆菌复制起始点和相应的细菌选择标记，通过 界的单酶切位点进行酶切、连接和细菌转化，从而使目的片段通过大肠杆菌进行复制。这是研究插入侧翼序列较直接和常用的方法，目前已建立了部分拟南芥 1999） 。 反向 用已知的 列设计两个引物，通过反向 可得到位于 端的植物 1998）。 反向 差别筛选结合的方法不仅可用于分离高拷贝转座子元件标签的基因，而且可用于克隆其它微小变异株中被标签的基因，加速低拷贝转座元件标签基因的分离。此外，采用嵌套的反向 物可以提高有效扩增侧翼序列的产量。 1995）： （ 1997）用 法来分离转基因拟南芥入位点的侧翼序列，这是一种代替反向 其有效的方法，可以用来扩增任何已知序列侧翼的未知序列（ 2001）。该方法是嵌套 抑制 结合。它是将完整的基因组 平端限制性内切酶消化，然后在酶切段上连接上平端接头，这种接头具有两个特征，可以限定在接头引物和特异性基因引物之间扩增。接头的两条互补链长短不等，接头的长链具有与接头引物 补的连续序列，与短链在 3端互补，而短链的 3端缺乏 物结合位点，并且具有氨基基团，氨基基团阻止了在聚合酶作用下合成产生 合位点。因此接头引物结合位点只能通过基因特异性引物延伸出来的接头长链互补链而产生。即使在一定条件下，产生了从 扩增片段，也由于末端重复形成手性结构，因而不能扩增。正是由于以上特点， 证了扩增产物的特异性（图 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 6 图 术扩增 翼序列的原理 南芥和水稻插入突变体库研究进展 南芥插入突变体库研究进展 作为双子叶的模式植物，拟南芥基因组仅 120其基因的内含子较小，很少重复序列，故插入一段 5的 常会极大地干扰基因的功能。若为纯合致死突变，则可以杂合子的形式进行群体保存。 1990 年， 利用组织培养法建立了拟南芥的 入诱变体系，并克隆了与叶色相关的基因。不断完善的转化技术大大地提高了诱导效率，许多重要的功能基因相继问世。 T 整合到染色体上是一个随机的过程，但近年来的研究表明这种随机性只是相对的， 先整合于染色体中基因丰富，转录活性高的区域（ 2000）。对 1，000 个 签在拟南芥基因组中分布情况的分析表明，只有 签位于染色体的着丝粒、端粒和 复区等基因密度低的区域； 入在基因起始和终止密码子之间的区域，其中 于外显子区， 于内含子区，这与预测的外显子、内含子的长度分布相吻合；然而 入到 5端起始密码子上游 300内和 3端终止密码子下游300内的非翻译调控区的频率要比随机插入的频率分别高出 ，说明 倾向于插入上述区域（ 2002）。 目前，已经建立了多个拟南芥插入位点特异序列的数据库，科研工作者可以根据目的基因的序列检索数据库就可以找到并进而索取目的基因被敲除的突变体品系。例如，登录到 究所的基因组实验室 （ 的网站就可以检索敲除了目的基因的 入突变体。如果相关的突变体已经发布，就可以向有关机构索要或购买 。 稻插入突变体库研究进展 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 7 稻 入突变体库的建立 建立大规模的水稻突变体库 是水稻功能基因组学研究的重要平台。快速、高效、可重复性好的水稻遗传转化系统对于水稻插入突变库的建立至关重要。根癌农杆菌介导的遗传转化方法具有操作简单，转化效率高，嵌合体少， 入的拷贝数少，转入基因以孟德尔方式遗传等优点，是进行大规模、高通量转化的首选方法。使用成熟胚来源的愈伤组织为受体材料，比起幼胚来源的愈伤组织或其它来源的外植体，具有操作方便，取材不受季节限制等优点。 首先建立了实用的农杆菌介导水稻转化程序，并给出了详细的分子证据（ 1994）。 该方法进行了改进，提高了 转化效率，将转化过程所需的时间缩短到三个月（ 1997）。影响转化效率的因素很多，主要包括受体材料的状态，培养基成分，菌株和载体的类型，选择标记的种类和浓度，共培养条件等（ 1997）。当使用愈伤组织为受体材料时，应选择细胞分裂旺盛，淡黄色有光泽的胚性愈伤组织进行转化，培养基中添加脯氨酸和水解酪蛋白有助于胚性愈伤组织的诱导；超毒力农杆菌菌株如 转化效果要好于 普通菌株；以潮霉素为选择标记的双元载体系统在水稻转化中应用最为普遍，潮霉素的选择压力以 50 较为适宜。 在农杆菌向植物细胞的转移过程中，一系列 因的活化至关重要（ 2000）。许多环境因素参与 因的活化，包括低 ，低温，高渗透压和一些酚类化合物如乙酰丁香酮等。研究表明，农杆菌的侵染在 19为活跃，温度升高至 29以后，侵染便不会发生（ 1996）。农杆菌介导的水稻成熟胚来源愈伤组织转化效率（得到的转基因系数目 /侵染的愈伤组织数目 一般在 10%到 50%之间， （ 2003）通过对愈伤继代培养等改进，把转化效率提高到了 75%以上，这对加快水稻基因标签系的构建速度具有重要意义。 （ 2000）首先报道了水稻 入突变库的构建。他们获得了 30， 000 个可育的签系，插入的平均拷贝数为 这些标签系总共含有约 42， 000 个 签。目前，水稻 入突变库（ 2003； 2003； 2004），激活标签库（ 002）和基因捕获标签库（ 2003； 2004）的构建均有报道。水稻 签库已经成功的应用于基因的功能分析（ 2003； 2003； 2003）。表 出国内外标签突变库的研究现状。 稻 入突变体库的分析及存在的问题 T 入的效应是多方面的。第一， T 入的平均拷贝数为 30标签系为单拷贝插入，如果是多拷贝插入， T 组或交换常引起基因沉默，这将干涉由 T起的表型鉴定的难度。第二， T 整合左右边界很复杂。 （ 2003）研究发现， 右边界较为稳定，超过一半的 末端在正常的位点切割，而左边界保守性较低，缺失片段长度可达 180基因组 3 种连接类型：一种类型是连接处有多达 7 个核苷酸的重叠，左边界出现这种情况的频率要大大高于右边界；另一种类型是直接连接，没有任何重叠或填充序列，这种情况在右边界更常见；还有一种类型是在 植物序列之间有填充 列。在检测的 171 个样品中， 77 个样品包含有载体的骨架序列，这是由 载体、 列的共整合引起的。当 入为多拷贝时， 第一章 文献综述 8 重排的频率可高达 35%，这 对 翼序列的分离是一个不利因素（ 2003）。第三，签在水稻基因组中的分布模式和拟南芥中的情况类似，这可能是由 合的机制决定的。 （ 2003）对超过 1000 个 签的分析表明， 向插入染色体中基因丰富的区域，只有 标签在重复序列区； 标签在基因内部， 标签在基因间区，与这些区域在水稻基因组中预测的长度分布相吻合。 优先插入编码区 5端和 3端外侧各 500内的调控区，以及内含子区域。 （ 2003）从 6， 749 个水稻标签系中分离了 3， 793 条 翼序列，并建立了侧翼序列数据库，他们的分析表明， 1， 846 条标签在基因内部， 1， 864 条在基因间区；在编码区起始和终止位置，以及接近 始密码子的上游区域插入的频率较高；所有插入位点的平均 量与水稻全基因组的 量接近， 1， 846 个被 记”了的基因按功能分类后的分布比例也与水稻基因组中各类基因的分布比例相似，表明 插入基因的类型上没有倾向性；在 1， 4， 10 号染色体上分别有 764， 327，346 条 签，插入 频率在染色体末端较高，着丝粒处较低；在某些特定的区域，插入频率会比周围的区域高。对 翼序列的随机测序分析能够在基因组水平分析大量基因的功能。第四， 的分离就可以很容易鉴定出突变的表型。典型的孟德尔式分离比应为 3： 1（正常植株数目：突变植株数目），但在实际应用过程中受各种因素的影响，分离比常常会发生一定程度的偏离。由于水稻植株相对于拟南芥要高大得多，生长周期也较长，因此水稻突变库需要很大的种植面积，表型筛选也很费时费力，一般在一个种植季只能对部分植株进行筛选，其余标签系的种子可以在种质库中保存。 2001）对 1600 个标签系的表型分析表明，矮化（ 和叶色（ 变化是最为常见的突变表型。叶色突变包括白化叶，叶色淡绿和条斑叶