【毕业学位论文】（Word原稿）油菜蜂花粉中活性肽的制备及其抗氧化性的研究特种经济动物饲养毕业论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 油菜蜂花粉中活性肽的制备及其抗氧化性的研究 I 摘 要 油菜蜂花粉是自然界中存在的营养 丰富的一种纯天然食品，营养成分搭配合理，并且富 含蛋白质和 功能因子，能够加强人体的免疫系统和生理功能，已经日益受到人们的青睐。但是由于 油菜 蜂花粉本身带有青涩味，口感较差，使得蜂花粉的利用 率较低。 油菜蜂花粉中 蛋白 约占干重的 30%， 成分较为复杂，难以提取和分离。本文利用三种不同蛋白酶将油菜蜂花粉水解，以水解度 为标准，选择对油菜蜂花粉水解效果较好的蛋白酶，其中碱性蛋白酶在 适宜的条件下 水解 效果最佳。 故用碱性蛋白酶水解油菜蜂花粉，并 通过不同的渗透滤膜对 酶解物 进行分离纯化，按照 相对 分子 质 量分成 4 种样品： 2001000100050005000100000000上不同分子量段的样品 ， 应用清除超氧阴离子自由基、清除羟自由基和脂质过氧化三种抗氧化模型对油菜蜂花粉水 提物、酶解物及酶解物分段后样品进行抗氧 化能力评估。试验结果表明：油菜蜂花粉酶解物 清除超氧阴离子和羟自由基的能力得到显著的提高，在 50mg/浓度下抑制能力分别提高 20%和30%左右， 而且 酶解物 经渗透膜过滤后能 进一步 提高 样品的抗氧化能力 。 关键词 油菜蜂花粉 ， 酶解 ， 膜分离， 抗氧化活性 ee is a to of it is to of in 0% (w/w) to be to in to a to on by 20010001000000500010000Da 0000of bu in of It of of an to of of 录 第一章 绪论 . 1 花粉的研究现状 . 1 物活性肽的研究现状 . 3 花粉中活性肽的研究现状 . 5 氧化肽的研究现状 . 6 . 7 . 7 第二章 油菜蜂花粉中粗蛋白的分类提取及其抗氧化研究 . 9 验材料和方法 . 9 . 9 . 9 果与分析 . 10 结 . 12 第三章 油菜蜂花粉酶解条件的研究 .验材料和方法 . 13 . 13 . 13 . 14 菜蜂花粉酶解条件的单因素实验 . 14 . 14 . 17 . 19 种蛋白酶最佳条件下水解度的比较 . 22 结 . 22 第四章 油菜蜂花粉酶解物和水提物抗氧化研究 .验材料和方法 . 24 . 24 . 24 . 24 菜蜂花粉酶解物和水提物抗氧化性研究 . 25 . 25 酶解物和水提物抗超氧阴离子自由基能力 . 25 . 26 . 27 菜蜂花粉酶解物中主要抗氧化成分的抗氧化能力分析 . 27 . 27 油菜蜂花粉酶解物中主要抗氧化成分抗超氧阴离子的能力 . 28 . 29 结 . 29 第五章 油菜蜂花粉酶解活性肽分离技术的研究 .验材料和方法 . 32 . 32 . 32 验结果和分析 . 32 . 32 . 35 结 . 36 第六章 油菜蜂花粉酶解活性肽的抗氧化研究 .验材料和方法 . 37 . 37 . 37 . 37 果和分析 . 37 . 37 . 38 . 40 . 41 结 . 42 第七章 结论 .考 文献 . 谢 . 者 简 历 . V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 ee 菜蜂花粉 ,2,2氯乙酸 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 花粉是显花植物的雄蕊花粉囊中的粉状体 (生殖细胞 )， 携带着植物的遗传信息 ， 是非常珍贵的具有生物活性物质的浓缩物 。蜂花粉则是蜜蜂利用自身特殊的构造从蜜源植物的 花药中采集的花粉粒，向其混入花蜜和唾液，加工成不规则的扁圆形颗粒，由蜜蜂后肢上的花粉筐携带回蜂巢中。 蜂花粉是自然界中存在的营养最丰富的一种纯天然食品，并且营养成分搭配合理，有利于人体吸收，另外它还含有许多功能因子，能够加强人体的免疫系统和生理功能，已经日益受到人们的青睐 （许家喜等 ， 1999） 。蜂花粉中的营养和功能成分包括 22种氨基酸、 14种维生素和 30多种微量元素以及多种活性蛋白酶、核酸、激素、黄酮类化合物及其他的活性物质。其中蛋白质 7% 35%（ 948 ； . ， 1975 ） ， 氨 基 酸 占 总 量 的 20% 以 上 ， 游 离 氨 基 酸 1% 2%(， 1989； 碳水化合物 40% 50%，脂肪 5%10%(974)。 世界花粉资源丰富，我国列于国际前列。花粉虽小，但产量惊人，目前国内外生产花粉多采用蜜蜂采集，据调查研究每群蜂每年可采集生产 30国养蜂群数为 600 700万群，每年可产蜜蜂采集的花粉约为 210,000万千克，而非蜜蜂采集的花粉量则更多，目前我国每年仅生产蜂采集花粉 1000多吨，仅仅为资源 量的1/210。而全世界约 30多万种高等植物，可见花粉的产量何其丰富，确实是世界未来重要的营养源之一。 多年来我国花粉的基础研究和应用研究己全面深入地开展，并取得了可喜的成果，有些方面已进入国际研究的前沿。我国的花粉研究是从不同角度、多学科、多领域的参与、综合开展研究的，从花粉资源，花粉有效成分和物质组成，花粉的保健、药理、药效、花粉的扩大应用，花粉的生产技术，加工工艺，新产品开发利用等都展开了广泛而深入的研究，获得了大量的研究成果。 目前花粉的研究主要集中在花粉破壁、花粉提取液及其提取液中的功能因子上。 花粉破壁与不破壁一直是人们议论的焦点。花粉破壁论者认为花粉破壁能够将花粉的内涵物充分的释放出来，使人体能够更好的吸收其中的营养物质。华中农业大学的胡筱波等采用温差破壁法分析比较了温差破壁法对油菜蜂花粉中主要营养素含量的影响，研究结果表明：同种花粉破壁后的蛋白质含量比破壁前提高了 4，脂肪含量比破壁前提高了 2，维生素含量略微增加，还原糖的含量变中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 化不大，破壁后 胡莜波等， 2005） 。花粉不破壁者认为花粉破壁会造成某些活性成分的破坏，也破坏了花粉 的天然结构和配比，会对人体造成营养性障碍或潜在的致病因素。我国 的学者 通过高等动物空腹喂饲试验，发现了高等动物吃不破壁花粉，在渗透压作用下，通过花粉细胞壁的分子间隙及萌发孔， 可以吸收其中部分或大部分营养物质，不同的报导综合为最少吸收率为 30，最多吸收率为 80以上。因此，即使花粉不破壁人体也能吸收其中的大部分物质，只要食用大量的花粉，就能达到人体所需的要求 （陈德芳等 ,2003） 。 目前花粉破壁一般采用机械法和化学方法。机械法一般采用外界的作用力使花粉的外壁破损，从而使花粉内涵物释放。化学法是采用纤维素酶或果 胶酶来消化花粉的外壁从而使内容物释放。花粉破壁利于花粉的加工，但是破壁的花粉失去了天然的生物保护膜，容易受外界条件的影响，活性成分易受到破坏。而不破壁的花粉利用的物质毕竟有限，造成了资源的大量浪费，因此，现在提倡一种 “微观破壁 ”法，这对花粉研究者提出了新的更高的要求。 国内的许多科技工作者对蜂花粉的提取液进行了一系列的功能研究。张荣标 、何聆等研究了油菜蜂花粉对正常小鼠免疫功能的影响，试验得出，一定剂量的油菜蜂花粉能明显提高迟发型变态反应水平、促进抗体生成细胞的生成、升高小鼠血清溶血素抗体水平 、 增强小鼠碳廓清 能力 ， 并能明显增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力以及增强小鼠 张荣标等 )。许立薇等研究了油菜花粉混悬剂连续灌胃对幼年小鼠体重增长和学习记忆的影响，实验表明，油菜花粉混悬液对幼年小鼠的体重增长无明显促进作用，但是能增强小鼠学习记忆功能，且潜伏期有所延长，呈量效关系 （ 许立薇等， 2000） 。 蜂花粉中黄酮类物质在清除自由基中的作用及保存时间对清除能力影响进行了研究 （ .， 2003） 。花粉的自由基清除的效果决定于组成它的花粉粒 ， 这些花粉 (常常是完全相同的 )，用标样做对照 ， 分离的组分有同样的效果，在很大程度上类黄酮或酚成分的自由基清除活性决定了 尽管其它的一些成分 (或许是蛋白质 )起到的作用会占到活性的一半，随着储存 (老化 )这种活性会显著降低。 日本的池野久美子，柿本佳名子等用 80%乙醇提取得蜂花粉提取液进行了体外抗氧化实验，并用同样的方法与蜂胶、蜂王浆和蜂蜜的抗氧化性进行了比较，试验表明，蜂胶具有第一强的抗氧化能力，其次蜂花粉具有强的活性，蜂王浆和蜂蜜没有那样程度的抗氧化作用，在蜂蜜中只有荞麦蜜有稍微强的 陈东海译， 2005） 。 王礼国等 （ 2005） 对蜂花粉多糖的抗菌效果进行了研究，结果表明高浓度蜜中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 蜂花粉多糖对多杀性巴氏杆菌、猪丹毒杆菌、沙门氏菌有不同程度的抑制作用，而对其他的细菌则效果不明显。另外他们还进行了蜂花粉多糖对动物急性毒性试验与降血脂效果的研究，结论是花粉多糖能降低脂肪在血管壁上沉积速度，能显著降低大鼠血清中 对大鼠血清中 粉多糖对雌、雄性小鼠急性经口 15000mg/据急性毒性（ 量分级及标准均属无毒。 厉阗等 （ 2004） 用甲醇提取 不同蜂花粉中的功能成分进行体外抗氧化实验，结果表明 ： 5 种蜂花粉均具有较强的抗氧化作用 ， 其中荞麦花粉甲醇提取物对超氧阴离子的清除作用和脂质过氧化的抑制能力最强；油菜花粉甲醇提取物对羟基自由基和二苯代苦味酰（ 由基的清除能力最强。认为 蜂花粉是一种有前途的天然抗氧化剂 。 魏永生 ， 郑敏燕 （ 2005） 研究了油菜蜂花粉黄酮类物质的提取及抗氧化性，介绍了一种油菜蜂花粉总黄酮提取工艺 ， 研究了黄酮提取物对猪油的抗氧化性能 。结果表明 ， 采用食用酒精冷浸法提取油菜蜂花粉中的总黄酮 ， 工艺简单 ， 产品物理性状好 ； 由样品的 黄酮提取物对油脂具有抗氧化性 ， 在猪油中添加 提取物时 ， 其抗氧化能力强于添加 胡筱波等 （ 2006） 以陈放一年的油菜花粉为原料，比较了油菜花粉的两种破壁方法 ： 温差破壁法和蒜汁酶破壁法，通过比较破壁前后各组分蛋白含量以及抗氧化活性确定了球蛋白为目的蛋白，并在此基础上确定了球蛋白的最佳提取条件。研究结果表明，目前条件下温差破壁法可达到实验目的，破壁脱脂后的油菜 花粉中主要是球蛋白和谷蛋白；球蛋白的最佳提取条件是氯化钠浓度 ， ，浸提时间 6h，浸提次数 3次，浸提温度保持 4 。 蜂花粉是蜜蜂王国中重要的食物原料，经蜜蜂加工成蜂粮供蜂群长期使用。蜂花粉也因为其营养全面，适合人体正常生活所需要而被誉为 “最理想的天然营养源 ”、 “全能的营养食品 ”、 “浓缩的天然药库 ”等。因此，研究蜂花粉中的营养成分以及对其进行深加工已成为学者研究的一个主要课题。 物活性肽的研究现状 生物活性肽是由氨基酸构成的，通过氨基酸肽键连接起来的 多 肽。生物活性肽不同于蛋白质，具有蛋白质的特性和特殊的生理功能。随着具有各种生物活性肽的不断发现，其研究和 开发日益受到各国科学家的关注 （闻正顺， 2007） 。 获得生物活性肽的途径有 3种，一是从天然生物体中提取，如灵芝 （林树钱等，2003；焦迎春等， 2004；何慧， 2001） ；二是在消化过程中产生或体外水解蛋白中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 4 质产生；三是通过化学方法、酶法，重组 大量科学研究表明，通过选择适当的蛋白酶，水解的蛋白质可以得到大量的具有各种生物功能的生物活性肽，这些活性肽不仅具有极其广泛的活性和多样性，而且其来源丰富、成本低、安全性好、操作简单、便于工业化生产，因此已成为科学家们研究的新热点。 目前研究最集中的是动物乳 中的蛋白。自从 1979年， 蛋白源的生物活性肽方面的研究进展迅速，其生理功能越来越引起人们的重视，并日趋成为乳品领域研究的焦点 （ 2000） 。到目前为止，已经发现了几十种具有重要生理功能的生物活性肽，这些肽类具有非常重要和广泛的生理学功能和调节功能。如：酪蛋白磷酸肽具有促进 收的功能；乳蛋白的肽类、酸奶肽类及鱼贝类肽类等具有抗血压的功能。 植物蛋白生物活性肽中以大豆肽的开发最早，早在 60年前 ，日本的不二制油公司就开发出分子量在 2400 5000用于功能性饮料、运动营养食品、健康食品、酸奶及味精的生产。大豆多肽具有多种生理功能：易消化、易吸收、降胆固醇、降血压、促进脂肪代谢和减肥、增强运动员肌肉和抗疲劳、促进矿物质吸收、抗氧化、促进双歧杆菌和乳酸菌增殖等，并且不易发生热变性。最近报道日本已经从豌豆中制得二肽类： 性 性，这些肽口味温和，富含赖氨酸。国内关于大豆蛋白生物活性肽的报道很多，对于蛋白的酶解条件和功能都有比较深入的研究 （吴建 平， 1998） 。 玉米肽主要来自玉米蛋白的水解产物，是由分子量很小但活性很高的短肽分子组成。玉米肽具有抗高血压、 降血脂 、醒酒等功能。目前制备玉米肽的原料主要是玉米蛋白粉或从其中提取的玉米醇溶蛋白。赵金兰 （ 1999） 用玉米渣生产降血压活性肽，并通过动物实验表明对人体具有良好的功能。 江南大学的谷文英 （ 2001） 等通过酶解玉米蛋白粉制备高 得高 善术后和卧床病人的蛋白质营养状况以及抗疲劳等生理功能。 离获得了 9种 中的 00mg/0大米蛋白中获得的 具有阿片样拮抗活性，又具有免疫调节功能，浓度为 1时， 噬指数为控制值的 外 本太阳化学公司 、 陈季旺， 2003） 。 活性肽类食品在日本、美国以及西欧早已上市，而我国 对活性肽的研究和开发尚处于起步阶段。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 5 华中科技大学的顿新鹏 （ 2004） 通过酶法水解米渣蛋白制备大米小分子肽，大米蛋白中 80%以上为谷蛋白，而谷蛋白中赖氨酸含量高，得到的分子量均小于5000其 中 分 子 量 小 于 1000 其 中 平 均 分 子 量 为 平均分子量为 960平均分子量为 215 另外，海洋生物活性肽的研究始于 60 年代，迄今为止已经发现具有重要生理及药理活性的化合物达 2000 多种。近 10 年，海洋药物研究与开发取得了很大的进展 。肽类毒素研究成为海洋活性物质研究中发展最迅速的重要领域之一。它们具有良好的麻醉、强心、抗癌、抑菌和抗病毒作用。为人类战胜疾病提供了良好的工具药 （林伟锋等， 2003） 。 花粉中活性肽的研究现状 蜂花粉中的蛋白含量相当丰富，它不仅含有大分子的蛋白还含有易于人体吸收的小分子生物活性肽。 为了揭示花粉中营养物质的有益成分，合理地开发和利用花粉资源，近几十年来科学家对花粉中的有益成分进行了广泛的研究。 1991年 玉米花粉中分离得到多聚半乳糖醛酸酶 ， 为含有 410个氨基酸残基的多肽，与从 其他途径获得的该类酶具有很好的相似性，该酶在花粉形成的后期可以被大量表达出来。 1995年 肽为与翻译启动因子 于 究表明，在雄性配子体发育过程中 ， 杨玲， 2002） 。 我国，在 20世纪 90年代初开始了花粉多肽的研究工作。万开科、宋艳玲、季爱雪等 （ 1995） 从我国丰产的油菜花 粉中分离出了油菜花粉十二肽 并进一步研究了此肽的结构与活性的关系，设计并用 通过 许家喜， 1995） ，初步讨论了它们在固体状态和不同溶剂中的结构问题。同时，用肿瘤坏死因子 果表明该十二肽和它的某些片段具有增强 许家喜、金声 3 1 从比较特殊的罂粟花粉中分离得到了 4种多肽 定了它们的序列。 2 士学位论文 第一章 绪论 6 用固相法合成了其中的十三肽 （许家喜， 1999） 和十七肽 （许家喜， 1997） ， 经 确定了分离肽的一级结构。用 过 实验 ， 生理活性测定方法表明它们具有一定的促免疫活性。 王霞、刘俊达等 （ 1999） 用 相法合成了荞麦花粉 肽 其类似物 过 初步讨论了 二级结构 ， 结果表明其水溶液构象属于无规卷曲和 但在三氟乙醇中 ， 在206 222近呈双负峰形 ， 分子形成了 研究了 动物和人淋巴细胞的增殖应答功能和抑制释放 作用 ， 结果显示它们具有较强的促免疫活性 。 浙江大学的硕士研究生周键 （ 2004） 从油菜花粉中提取纯化了蛋白免疫因子，并对其理化性质和功能进行了研究 。 研究表明，所提取 的蛋白免疫因子具有提高溶血素的水平和 T 淋巴细胞的转化功能。 随着蛋白质功能学的兴起，生物技术和加工技术的日益成熟和完善，为蜂花粉中有益成分的提取和功能性研究提供了基础。在今后几年里，蜂花粉中蛋白质的提取和纯化，功能性研究及其利用也将有非常美好的前景。 氧化肽的研究现状 抗氧化剂近些年来在国内外发展很快，用途也越来越广。自从 们认识到人体内氧化产生的自由基与人的衰老和许多疾病有关。在组织中由于自由基引起的毒性反应在各种神经衰弱疾病发病机理中起着非常重要的角色，各种神经衰 弱症包括帕金森综合症，萎缩 阿茨海默病和心肌缺血再灌注损伤等 （ 2004） 。因此 ， 抗氧化剂不仅用于含脂肪食品的抗氧化，而且作为功能因子用于保健食品及化妆品等的开发。抗氧化剂的种类很多，然而随着人们对化学合成的抗氧化剂如 们把目光逐步转向天然抗氧化剂，从各种 动 植物组织中提取，如茶叶中的茶多酚、大豆中的大豆异黄酮 、骨骼肌中的肌肽、枸杞中的枸杞多糖、大豆蛋白分解得到的大豆肽等 (刘明 ,2006)。关于多肽类物质的生理功能的报道很多，如 抗 高血压、免疫活性、抗菌、运输微量元素、抗癌等。食品和机体的抗氧化剂 是近年来国内外科学工作者们较新的研究课题，这些研究使人们对多肽的生物活性有了新的认识，也为保健食品的开发提供了一个 有前途的基料 （包斌等， 2004） 。本文就目前关注较多的植物蛋白多肽大豆肽和动物蛋白多肽肌肽的抗氧化性能研究进行了阐述。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 7 豆肽 大豆是全世界应用最广泛的植物蛋白质资源，其显著的优点是较高的蛋白质含量和氨基酸消化率，并富含赖氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和玉米、高梁等能量饲料中严重缺乏的一些必需氨基酸。与具有相同氨 基酸组成的大豆蛋白质相比，大豆蛋白酶解物中的大豆多肽具有许多独特的理化特性与生物学活性，大豆蛋白酶解物中存在具有抗氧化活性的肽 （张莉莉等， 2005） 。 （ 1995） 发现大豆蛋白酶解物具有抗亚油酸脂质过氧化作用，并且从中分离得到了 6种抗氧化活性肽，其中分子量最小的是一个 5肽( 陈美珍等 （ 2002） 发现大豆分离蛋白酶解物具有清除羟自由基的能力，以分子量 5,154 11,355的肽段清除能力最强，清除能力主要与暴露的氨基酸侧链基团和肽序列有关。 张学忠 等 （ 1999） 发现在反应体系中添加 40mg/苯三酚自氧化速率被抑制 27，说明大豆酶解物具有清除超氧阴离子作用，减少人体红细胞氧化溶血程度以及抑制脂质氧化导致的脂质体膜的破坏，抗氧化肽的分子量分布在100 1300 荣建华等 （ 2002） 研究表明，大豆分离蛋白经中性蛋白酶 到的酶解物具有较强的抗氧化活性，在浓度 250在上述浓度下无促氧化作用。 肽 肌肽是一种天然二肽 ， 存在于脊椎动物的骨骼肌和大 脑等组织中，其化学本质是由 肽具有很强的抗氧化性，其结构中含有咪唑环，因此具有螯合金属离子的能力，特别是对铁及铜离子（张岚 ， 2007） 。 2002） 实验表明，肌肽与超氧阴离子的反应速度相当慢，当 能与羟自由基反应所达到的。肌肽是自由基清除剂，直接发挥对氧自由基的淬灭作用，肌肽侧链上的组氨酸残基可以作为氢的受体，具有捕捉羟基自由基，单质氧和过氧化氢自由基的作用。 （ 2003） 报道肌肽的确对铜催化的脂肪反应产生的抑 制作用最强，他们发现肌肽与铜形成了非活性的复合物。当肌肽浓度为 )的 100 1000 倍时， 4 个肌肽分子通过咪唑环 )形成四聚物，抑制了铜的催化活性，而人认为，也可能是肌肽与金属离子的复合物，并不会影响金属离子的催中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 8 化活力，但由于复合，使肌肽与自由基产生点极接近，自由基一旦产生，便马上被肌肽清除，从而减缓了氧化反应。 为 ， 肌肽能作为氢供体维持铁离子的二价状态，使其不能与 发生电子传递而产生自由基 ， 从而也达到抑制铁催化脂氧化的效果 （ 2001） 。 张梦寒等 （ 2002） 采用正交试验研究了肌肽对卵磷脂肪质体的抗氧化活性。结果表明，在 100010 - 6 抗坏血酸存在的条件下，各种浓度的肌肽均抑制了铁离子引发的脂质体脂类氧化。 （ 2002） 通过添加不同浓度的纯肌肽于绞碎的猪肉中，测定其 ， 同时与三聚磷酸钠及 抗氧化剂做比较，并测定其对储藏期间绞碎猪肉的保存效果。结果发现，添加 肽即可以有效地抑制加盐绞碎猪肉的氧化作用。 （ 2002） 建立了一个由铁催化产生羟基自由基 以使脱氧核糖降解的体系，发 现肌肽可以有效抑制脱氧核糖的降解，表明它具有捕捉羟基自由基的能力同时还研究了肌肽在脂质体和牛肉中的抗氧化作用，发现肌肽在磷脂酰胆碱脂质体中抑制形成的效果与体系中存在的金属离子有关。 目前，对于抗氧化肽的研究主要分为植物蛋白多肽和动物蛋白多肽。蛋白质经酸水解、酶解等方法处理后均可得抗氧化肽，由于酶促反应条件温和易控制、专一性较强、副产物少等优点，因此以酶解方式利用得最多 （ 丁晓雯， 2003） 。研究表明 ， 以一定的蛋白质为底物，在适宜的酶作用下可产生小