核型分析.doc

人外周血淋巴细胞的分离培养及核型分析一、实验目的1学习人体微量外周血分离培养的方法2学习应用培养淋巴细胞进行染色体制片的方法3了解人类染色体核型的基本特征4通过对人类染色体组型进行分析，初步学会对染色体进行分析的方法。二、实验原理人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养，白细胞中含有小淋巴细胞。外周血是制备动物染色体标本的重要材料之一。通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现，其他动物如两栖类外周血中也只是偶尔能见到分裂相。外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。在人工离体培养时，在培养基中加入一定剂量的植物血凝素（PHA）后，小淋巴细胞受刺激可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。外周血中的淋巴细胞经过68-72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。用秋水仙素（细胞分裂阻断剂）处理，积累分裂相，可使处在分裂期的淋巴细胞停留在分裂中期或早中期，从而获得足够的可供分析的中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。核型分析是指在有丝分裂中期，对染色体大小形态、数目测量，进行排队分组分析。不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。在显微镜下观察染色体的结构和数量。正常男性的染色体核型为44条常染色体加2条性染色体X和Y。正常女性的常染色体与男性相同，性染色体为2条XX。三、实验仪器与试剂1. 实验材料：人外周血淋巴细胞2. 实验试剂 RPMI“1640”培养基 、小牛血清（冰冻保存，用时在56水浴条件灭活）、肝素、生理盐水溶液（500U/ml）、5%NaHCO3、秋水仙素、植物血球凝集素（PHA）、双抗（青霉素：50000U/ml，链霉素：50000ug/ml）、2%碘酒、pH6.8的磷酸缓冲液、75%酒精、0.075mol/L KCl、固定液（甲醇：冰醋=3：1）、Giemsa原液。3.实验器材：电子天平、移液管、量筒、烧杯、试剂瓶、培养瓶 、毛细吸管、采血针、离心机、离心管、酒精灯、显微镜、载玻片、超净工作台、37恒温培养箱、无菌注射器（1ml、2ml、5m1）、橡皮塞、75酒精棉球、止血带、试管架、毫米尺、计算器四、实验步骤与方法（一）人外周血淋巴细胞的分离培养1、培养基的分装在超净工作台内，用量筒取 RPMI“1640”培养基40m1、牛血清10m1，用1m1注射器取肝素0.3m1、PHA 0.4m1、双抗0.3m1。混匀后，用5%NaHCO3调节PH至7.2。用5m1移液管分装入20m1培养瓶，每小瓶5m1，盖紧皮塞，胶布封口备用。2、采样接种用肥皂洗净供血者的手，再用2%碘酒、75%酒精擦拭指尖消毒，待酒精完全挥发干后，无菌条件下用无菌采血针刺破指尖，吸取外周血0.3-0.4ml，移入培养瓶，轻轻摇匀，尽量避免培养物与瓶盖接触。3、培养置37培养箱中培养72小时，每隔12小时左右轻遥1次，以促进细胞生长增殖。4、秋水仙素处理培养终止前6-10h左右加秋水仙素，培养液最终浓度为0.02ug/ml，摇匀后置培养箱中继续培养（以抑止细胞分裂，使细胞停留在分裂中期）。从培养箱中取出培养瓶，摇匀后移至10ml尖底离心管中，离心8min,2000r/min，尽量收集培养细胞。5、低渗处理离心后弃上清液，加入8ml预温37的0.075mol/L KCl，迅速摇匀，置37培养箱中10-20分钟，使红细胞破碎，白细胞膨胀。6、收集白细胞1000r/min离心5分钟，用吸管吸去全部上清液及沉淀上层较透明的部分，收集白细胞。7、固定沿管壁慢慢加入新鲜配制的固定液5ml，吸管吹打混匀，固定20分钟。1000r/min离心5分钟，弃去上清。再加入固定液5mL，用吸管轻轻打散，室温中继续固定15min后以1000r/min离心5min, 弃去上清液，留下白细胞制片。8、制片视离心管底细胞多少加入少量新鲜固定液，吹打成均匀悬浮液。取洁净冰水中预冷的载玻片，稍作倾斜，用吸管吸取一滴上述细胞悬浮液，与载玻片上方适当高度滴在载玻片上，立即吹散吹匀载玻片上细胞，置空气中凉干。9、染色载玻片充分干燥后，用PH为6.8的磷酸缓冲液按一份Giemsa原液，九份磷酸缓冲液混匀后染色。材料面向上，用染液覆盖载玻片，染色10-15分钟，用吸水纸吸取多余水分，干燥后即可镜检。10、镜检 低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，再在油镜下观察，选择染色体清晰，分散度好的细胞进行核型分析。（二）核型分析1、制备好的人外周淋巴细胞装片放到显微镜下，先用低倍镜寻找染色体分散良好的中期分裂相转换油镜仔细观察。2、观察23个分裂相，并寻找10个分散良好的分裂相进行染色体计数并拍照。3、将一张正常人中期分裂相照片分析，仔细辨认每条染色体，并用铅笔在其旁边注明序号或组别，先找出A、B、D、E、F、G组，最后辨认C组。4、将照片上的染色体逐个剪下，使短臂朝上，长臂朝下，依次排列在预先划分好了分组横线的报告单上，并使着丝粒于一条直线上，校对调整。5、用牙签挑取少许胶水小心地将每号染色体都依次贴在报告单上。6、分析结果：辨别该核型的性别，并记录核型。五、实验记录 人的一个典型的中期细胞染色体都已纵裂成2条染色单体，称姐妹染色单体，由一个着丝粒相连。每条染色体以着丝粒为界可分为长、短两个臂。根据着丝粒位置的不同，可将人类的染色体分为中部着丝粒染色体、亚中部着丝粒染色体、近端着丝粒染色体和端部着丝粒染色体四类。 46条染色体中的44条男女共有的常染色体分配成A、B、C、D、E、F、G七个组。对于另外的一对性染色体也根据形态大小归类，X染色体归到C组。Y染色体归到G组。人类染色体分组与形态特征见表1。表1 人类染色体分组与形态特征 组 别 染色体编号 大小 着丝粒位置 随体 A 13 最大 中央着丝粒（1、3号） 无 亚中央着丝粒（2号） 无 B 45 次大 亚中央着丝粒 无 C 612；X 中等 亚中央着丝粒 无 D 1315 中等 近端着丝粒 有 E 1618 较小 中央着丝粒(16号) 无 亚中央着丝粒（17、18号） 无 F 1920 次小 中央着丝粒 无 G 2122；Y 最小 近端着丝粒 21、22有 Y无六、实验结果与讨论染色体是遗传物质的载体，存在于分裂间期细胞的细胞核内。每一个体细胞含有两组染色体组，一组来自父方，一组来自母方，用2n表示。其中与性别直接有关的染色体，即性染色体，可以不成对。人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。染色体在复制以后，纵向并列的两个染色体，往往通过着丝粒连在一起。着丝粒在染色体的位置是固定的。由于着丝粒位置的不同，可以把染色体分成相等或不等的两臂，造成中间着丝粒，亚中间着丝粒，亚端部着丝粒和端部着丝粒等形态不同的染色体。此外，有的染色体还含有随体和次级缢痕。所有这些染色体的特异性构成一个物种的染色体组型。染色体的核型反映了细胞中染色体数量和结构的特征。根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置，将人的外周血淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G 7组共23种类型。每组染色统体形态大小不同，X染色体归入C组，Y染色体归入G组。本实验的人外周血淋巴细胞采于他人（男性）。根据各组染色体的特征予以分组： A组：包括三对染色体，即1、2、3号。它是最大的一组染色体，在长度上 三者略有差别。l号最大，中央着丝粒。长、短臂差别不大。长臂有时可见一狭窄的次缢痕；位置大约在离着丝粒1/3处，由于次缢痕的存在，往往导致长臂的长度发生变异。2号较1号小，为亚中央着丝粒染色体，长臂和短臂易区分开。3号是第二大的中央着丝粒染色体。是A组中最小的l个。这个染色体大约比第1号染色体短1/31/4 。B组：包括二对染色体，即4和5号。这是二对最大的而又特别明确的亚中央着丝粒染色体。这两对染色体的短臂相对较短，故易于与A组、C组相临号序的染色体相互区分。在非显带标本上，4号、5号不易区分。C组：包括七对常染色体，即612号，X性染色体也列入此组。中等大小，具亚中着丝粒染色体。该组染色体数目多，它们的大小相差不大，在常规标本中是最难将它们一一识别的。一般说，6、7、8、11号和X染色体的着丝粒略靠近中央，短臂相对较长，而9、10、12号染色体的着丝粒偏离中央，既短臂相对较短。第9号染色体的长臂上常有一较大而明显的次缢痕，从着丝点处延伸到长臂的中部。有时第11号染色体的长臂也会发现有次缢痕，位置在长臂的14l3处，第12号是C组中最小的一对，但不易与组内其它4对较短的相互区别。X染色体的大小在第7、8号之间。D组：包括三对染色体，即13、14、15号，是一组大的近端着丝点染色体。常规标本不易将三对染色体加以区分，本组染色体的短臂上均具有随体，但不一定同时显现。随体的大小存在着个体差异。外周血培养时，在叶酸和血清含量低的培养液中，随体的显现率有所提高。E组：包括三对染色体，即16、17、18号染色体。在较好的标本中。这三对染色体很易相互区分。第16号为中央着丝粒染色体，在长臂的近着丝粒处有一次缢痕，它的存在使这对染色体的长度有较大的变异。17号为中等大小的亚中央着丝粒染色体，其短臂能看得清楚。18号为亚中央着丝粒染色体，是E组中最小的一对染色体，其短臂很小；较易与17号相区别。F组：包括二对染色体，即19、20号，是最小的一组中央着丝粒染色体，这二对染色体之间不易区分。G组：包括二对常染色体，即21、22号，和1个Y染色体，是最小的一组近端着丝粒染色体，第21、22号有随体，但在同一细胞中不一定同时显现。第21、22号染色体长度略有差别，但为适应临床上已将先天愚型沿用为21三体(显带证明与此综合征相关的是较小的第22号染色体) 综合征的习惯叫法，根据巴黎会议（1971）的建议，把最小的一对改称为21号，稍大的一对称第22号，并排在21号的后面。Y染色体无随体，比21、22号染色体长些，通常着色较深，长臂端部模糊不清，长臂常较合拢，不那么分叉，着丝粒不明显。七、实验结论 人的一个典型的中期细胞染色体都已纵裂成2条染色单体，称姐妹染色单体，由一个着丝粒相连。每条染色体以着丝粒为界可分为长、短两个臂。根据着丝粒位置的不同，可将人类的染色体分为中部着丝粒染色体、亚中部着丝粒染色体、近端着丝粒染色体和端部着丝粒染色体四类。根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置，将人的外周血淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G 7组共23种类型。每组染色统体形态大小不同，X染色体归入C组，Y染色体归入G组。参考文献1 王亚馥,戴灼华.遗传学.北京：高等教育出版社.19992 项维,吕曼俐.科学通报.北京：科学出版社.1963（7）3 R.I.弗雷谢尼.动物细胞培养基本技术指南.北京：科学出版社.2004 4 孔庆友,孙媛,