细胞划痕ppt课件

.,1,细胞划痕实验,.,2,一、基本原理细胞划痕（WoundHealing）法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（例如24h），取出细胞培养板，观察周边细胞是否迁移（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区修复能力的不同，可以判断各组细胞的迁移与修复能力,.,3,二、实验步骤准备：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）1.先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.51cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。2.在孔中加入约5105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜，不同孔之间最好使用同一枪头。4.用PBS洗细胞3次，去掉划下的细胞，加入无血清或低血清培养基。5.放入37度5%CO2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。,.,4,cultureInsert方法（保证划痕的均一度）1.准备细胞，培养液。2.如图，将细胞接种于Dish中间的Insert，细胞长满Insert区域后用镊子移除Insert即可产生500m宽度的划痕。3.每隔4-6小时拍照记录。4.根据收集图片数据分析实验结果。,细胞定位格子培养皿,.,5,.,6,三、实验结果统计方法：使用ImageJ软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值，测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。其他结果分析工具：WoundHealingImageAnalysisWimScratchhttp:/dxy.me/UfYziiImageProPlus,.,7,.,8,划痕结果图,.,9,0h,6h,12h,24h,小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3,.,10,.,11,四、注意事项：1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（2%）否则细胞增殖就不能忽略。（也可用丝裂霉素处理一小时）3.按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。,.,12,特点：1.在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。2.价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。3.与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。4.研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。,.,13,举例：抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响（细胞划痕法）,一、实验原理：细胞划痕法是测定肿瘤细胞运动特性方法之一，其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上划痕致伤，加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力,二、实验材料：1）细胞系及其培养：肝肿瘤细胞HepG22）24孔板移液器倒置显微镜3）主要试剂：PBSDMEM培养液0.25%胰酶胎牛血清5-氟尿嘧啶溶液（1ug/ml）,.,14,三、实验步骤1制备单层细胞：细胞密度510105/mLHepG2细胞铺于24孔板（每孔500uL）上，加入含10胎牛血清的DMEM培养液培养1624h,使形成单层细胞2划痕：以五氟尿嘧啶（5Fu）为例，首先配制1g/L母液(使用无菌蒸馏水配制，精密量取），取45L该母液用PBS稀释至1.1mL，得浓度40g/mL5Fu溶液，用10uL移液枪枪头（或者无菌牙签）在单层细胞上呈一字划痕，用PBS清洗3次，然后加入上面配好5Fu溶液，平行两个样本，孵育24h，换成含10胎牛血清的DMEM培养液孵育24h3观察并拍照：吸去培养液，用PBS清洗3次，倒置荧光显微镜下观察并拍照,.,15,.,16,四、注意事项：1实验时应注意细胞生长状况，选择适当细胞接种浓度，对不同细胞要观察细胞贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适