相对荧光定量PCR的常用方法和注意事项

相对定量方法实际操作（常用方法）1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置）1). 先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。2). 同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中相同的样品在两页里命名成相同的名称，并定义为unknownP2P1分别分析P1和P2页选delta-delta Ct选项依次填入，并定义对照样品完成分析公式： F=2待检样品看家基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组看家基因平均Ct值待检样品目的基因平均Ct值 Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。应用实例：如上图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的M值分别为-3.525和-3.467，两者的差值0.1，因此，这组看家基因和目的基因可以用Comparative Delta-delta Ct法两进行相对定量。在完成上述预实验之后，接下来就可以正式对待测样品进行定量分析。在该实验中，分别对待测样品的看家基因和目的基因进行扩增，下图即为一个标准的扩增分析结果：为进行Comparative Delta-delta Ct分析，需要对样品进行一些编辑。简而言之，即将目的基因和看家基因分别编辑在两页中（page），并将同一样品命名成相同名称。在该实验中，分别对三个样品A、B、C进行了分析，其中1-9号管检测了看家基因，10-18号管检测了目的基因。可通过NEW新建一个page，并通过Selected选择每页中分析的对像。将两组基因分别编辑在两页中，并将相同的样品命名成同一名称后，即为下图所示：Page 1：看家基因，其中1-9号管通过YES选中，样品分别命名为A、B、C，其它未选中的样品可以不进行编辑。Page 2：目的基因，其中10-18号管通过YES选中，样品分别命名为A、B、C，其它未选中的样品可以不进行编辑。样品编辑好后就可进行分析工作。通过进入Analysis，分别对page1和page2进行分析。注意：由于没有标准品，软件无法自动给出阈值，需用手动设定，软件会提示需手动进行阈值设定，此时只要点中右侧按扭，在荧光曲线图中上下拖动光标即可。完成两页分析之后，再进入Delta Delta CT分析界面，选择show，此时，软件的向导界面会提示使用者一步步完成设置：由上至下，依次完成各项设置。第一项：Validation Run Performed，提示是否已验证过两个基因的扩增效率一致，可用该定量方法进行分析。选择Yes；第二项：Gene of Interest Quantitation，选中Page 1或Page 2中编辑了目的基因的那一页；第三项：Normaliser Quantitation，选中Page 1或Page 2中编辑了看家基因的那一页；第四项：Calibrator Defined，选中A、B、C三个样品中用来作为对照组的一个。完成上述四项设置之后，在窗口右侧就显示相对定量结果，如图所示：结果给出三个样品目的基因和看家基因的平均CT值，以及样品B、C中目的基因的浓度相对于对照组A的比值。2. 双标准曲线法定量流程（RG6000软件设置）1). 用双标准曲线法定量时，每次每个基因都需要做目的基因和看家基因的标准曲线，必需有一组稳定的标准品。2). 同一样品做标准曲线，分别对目的基因和看家基因做标准曲线，分列在两页上。稳定的梯度稀释标准品：梯度稀释的含目的基因的质粒或PCR产物，并设类型为Standard，给出浓度待检测样品：扩增目的基因unknown稳定的标准品：梯度稀释的含看家基因的质粒或PCR产物，并设类型为Standard，给出浓度待检测样品：扩增看家基因unknown同一待测样品命名同一名称，并设类型为unknownP1P2分别分析P1和P2页选Two Standard Curve选项依次填入，并定义对照样品完成分析公式： 待测样品目的基因浓度 待测样品看家基因浓度对照组看家基因浓度对照组目的基因浓度F=（基因的浓度由软件根据标准曲线直接给出）双标准曲线法的特点、注意事项及实际应用1. 双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-delta CT法那样对实验进行严格的优化。2. 其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。3. 并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定误差。应用实例：在该实验中，样品管1-6为目的基因的标准曲线，7-12为看家基因的标准曲线，待测样品A、B、C，其中15-17扩增了样品的看家基因，18-20扩增了样品的目的基因。在用双标准曲线法做相对定量之前，同样需要对样品进行一些编辑。方法与Delta-delta CT法类似，即将所有目的基因编辑在一个page里，所有看家基因编辑在另一个page里，且相同的样品以同样名称命名。编辑完成之后即得：Page 1：看家基因，其中7-12号管为标准曲线，通过YES选中，15-17号管为待测样品，分别命名为A、B、C，其它未选中的样品可不以不进行编辑。Page 2：目的基因，其中1-6号管为标准曲线，通过YES选中，18-20号管为待测样品，分别命名为A、B、C，其它未选中的样品可不以不进行编辑。样品编辑好后就可进行分析工作。进入Analysis，分别对page1和page2进行分析。完成分析之后，从Other进入，选择2 Standard Curves Relative Quantitation。根据提示向导依次完成设置。依次选中目的基因的page、看家基因的page以及对照组（例，以A为对照组），如图：结果包括计算所得的各标准品及待测样品的浓度及CT值，以及样品B、C的目的基因相对于对照组A的浓度。3. Comparative Quantitation法定量流程（RG6000软件设置）1). 该方法并不常用，因为必需确定起始样品的总核酸浓度一致。在芯片验证时使用较多，但同样也必需有起始浓度一致的核酸样品。2). 作为常规的基因表达调控研究，建议研究者使用前两种定量方法。3). 该方法通过拐点时的循环数来进行相对定量比较，重复性更好。4). 该方法操作非常简便，无需做标准曲线及设置内参。使用时，样品均定义为unknown，分析时选用Comparative Quantitation，确定对照组，完成分析。应用实例：用Comparative Quantitation法进行定量分析时，在保证起始总核酸量一致的前提下，只要对目的基因进行扩增即可，例：待测样品A、B、C，扩增目的基因。进入A