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文档简介

DNA的限制性内切酶酶切分析,实验十二,限制性内切酶(RestrictionEndonuclease,RE):由细菌自身产生，能识别双链DNA分子中特定的碱基顺序，以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键，产生粘性末端或平头末端,实验原理,EcoRI的作用模式图:,产生5突出粘性末端,*GAATTC*CTTAAG*,5,3,5,3,EcoRI,*G,*CTTAA,5,3,OH,P,AATTC*,G*,3,5,P,OH,5,5,EcoRI,Bcl-2(1.9kb),pBS(2.96kb),pBS-Bcl-2(4.86kb),Bcl-2重组质粒的酶切模式图,操作步骤（改动）,盖紧盖，掌型离心机混匀，37水浴反应1h,在做酶切之前，一定要将上次的质粒DNA沉淀溶解完全之后，再做今天的实验！,3.倒胶：胶冷却至60左右(不烫手)，加入核酸染料5l，混匀，将胶缓缓倒入电泳槽(先胶布封口，放好梳子)。,2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1TAE缓冲液60ml，微波炉加热中火，2min，摇匀，至无颗粒。（每班叫一位同学制胶）,4.点样：（学生）4l的6载样buffer加入酶切反应后的EP管混匀，吸20l混合物（老师示范点样）10lDNAMarker。(点样孔置负极端）,5.电泳：稳压条件下100V电泳，约30min.6.观察结果：紫外分析仪上观察，DNA存在处显绿色荧光条带，观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。,DNAMarker,已酶切质粒,未酶切质粒,750bp,500bp,100bp,2.96kb,1.9kb,点样孔,250bp,1000bp,2000bp,电泳结果,注意事项,1.第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离心到底部!2.当样品在37水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使反应体积大大增加，造成酶切失败。3.倒胶时不能有气泡，若有需立刻用枪尖吸掉或牙签挑破。,4.点样孔置负极一端，点样时也应检查点样孔中有无气泡，电泳前正确连接正负极。5.电泳时电压不超过5V/cm胶长。6.凡是用在酶切反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌。每次取溶液应使用新的Tip尖，避免污染。,思考题：,DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果会，请说明原因。比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳图谱，综合前两个实验，分析可能的原因,1.DNA中的DNase、蛋白、RNA、SDS、EDTA、酚、氯仿和乙醇等杂质都会影响酶切效果。2.DNA中的杂DNA、蛋白可与RE非专一性结合使酶活性降低，另外杂DNA也竞争酶的切口，往往造成切不动。3.DNA中的盐离子（如Mn2+、Cu2+、Co2+和Zn2+等）与有机溶剂（如酚、氯仿和乙醇等）都可抑制限制酶的活性或使限制酶失活或造成DNA切不动或使限制酶切割一些非特异序列(*活性)。,值日生要求,检查全
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