通过放空阀排出气泡PPT幻灯片课件

研发、制造、使用HPLC仪器的一些有关的关键问题李昌厚（中国科学院上海生物工程研究中心上海200233）高效液相色谱（以下简称HPLC）是科研、工农业生产工作中使用非常广泛的分析仪器之一。我国目前有近20多家企业生产HPLC仪器，但是，在HPLC的研发、制造、使用和维修方面目前存在很多问题，严重影响我国的HPLC仪器研发、制造、使用的质量。这里将根据仪器学理论和本人的实践，重点讨论HPLC仪器研发、制造和使用中影响分析误差的一些关键技术问题；对研发者、制造者和使用者、维修者都有参考作用。,1,1、泵、柱、检测器三者的关系和目前普遍存在的问题目前很多HPLC的研发者、使用者，没有搞清楚或没有完全搞清楚HPLC中的泵、柱、检测器三者的内在关系；所以制造者和使用者之间矛盾很多；导致广大使用者不能将HPLC用到最佳水平。积本人长期的研发和使用HPLC的实践经验，感到研发、制造、使用HPLC时，以下问题特别值得注重：,2,1)正确认识、处理HPLC的泵、柱、检测器三者的关系：(1)HPLC是一个系统；必须将泵、柱、检测器三者（三个部件）结合起来才能叫HPLC仪器；泵、柱、检测器三者都合格，联机后的整机系统才有可能合格，但不能肯定系统就会合格。只有泵、柱、检测器三者质量都合格，并且联机后检测结果也合格，才能说明这台HPLC是合格的。,3,(2)三个部件都重要，不能偏重哪一方面。三者谁是核心？谁最重要？目前，光谱、色谱工作者对此看法都各不相同、各有表述。我们不必去追究这些；本人认为应该说三者是一个整体，缺一不可，都很重要。(3)本人长期使用过HPLC，也研发过多种HPLC仪器1，实践使我深深认识到：必须将三个部件联接起来检验测试，并能达到整机质量指标要求，才能说这台HPLC达到了质量要求（合格）。否则，只能说是部件合格，,4,整机不一定能合格。为什么？因为：泵会因为柱子问题产生压力不稳、流量不稳定，会影响HPLC系统的质量；柱对泵影响很大；柱堵塞、柱沾污、柱接头漏液等，都会影响泵的压力波动、使流速不稳定；会影响系统不稳，使RSD变坏、峰拖尾、灵敏度降低；柱对检测器影响很大：柱效降低（柱塔板数降低）、柱堵塞、柱的新旧程度、接头、管道漏液等，都会影响检测器的检测限、分辨率、噪声、和灵敏度。,5,所以，泵、柱、检测器各个部分单独都合格，但是联接在一起时，可能会因为柱外效应（卡套、接头、气泡、干扰、进样器等）会影响系统的各项指标，导致整机不合格。2）目前制造和使用中普遍存在的问题和解决方法（1）过去我国很多公司在生产和检验HPLC中普遍存在的问题：一般都是将泵、检测器单独生产、单独自检、单独送质检部门检测；经质检部门检测后和未经检测的外购柱一起出厂，对使用者来说，等于买了三个部件，自己组装后使用。,6,在用户那里，因为条件所限，三者联机后会经常出现很多“问题”；其实这些“问题”都是应该在制造、检测过程中得到合理解决的问题，但是，这些问题移植到了用户那里。由于用户那里没有条件解决这些问题，于是就将这些“问题”都怪罪于仪器的质量，这很不科学、很不公平。这可能是我国HPLC经常在用户那里“出问题”、影响国产HPLC声誉的主要原因之一。解决办法就是制造厂将泵、柱、检测器三者联合在一起测试，保证联机测试合格才算合格、才能出厂。,7,(2)目前国内外某些企业，生产、检验HPLC时还未解决的问题：生产车间将检测器和泵两个部件分开自检后送质检部门检验。但质检部门将泵、检测器和“工装柱”三者联机检验。然后将泵、检测器和未经检测的外购柱，三者成套出厂。本人认为：我们这样做，存在很大的问题，不符合仪器学理论2的要求。我们不能用通用“工装柱”检验HPLC系统，原因见上述“、”所述。,8,请注意：色谱柱是易损件，用户会经常在色谱柱长时间使用后换新柱，此时HPLC系统的泵和检测器基本进入“电子元件失效理论的盆底1、2”，比较稳定了。所以，不会因为换新柱而产生仪器不能使用的问题。但是特别应该指出的是：用户换新柱后，一般不检测系统的综合指标；如果检测指标，可能仪器就不能达到原出厂指标（因为泵和检测器经过较长期使用后，质量会有所下降，旧泵、新柱、旧检测器三者不能达到最佳配备）。,9,用户换新柱不会影响使用的问题，可以从计量认证标准规范（JJG）得到佐证；JJG检验的仪器，很多是在用仪器，它明确规定被检仪器的指标可以比新出厂的仪器指标低，甚至有些指标因为达不到要求而免检。但我们的制造企业，在仪器出厂前，必须检测指标，只有系统指标达到设计要求时，才算合格，才能出厂。至于用户换新检测器、换新泵，同样都是允许的。,10,但是，如果要求检测换新泵或新检测器后整机系统的指标，则仍然必须要配换新柱；必须是合格的新柱、新检测器、新泵，三者联机检测指标。否则，会由于系统的泵、柱、检测器因使用时间长而指标下降，会使HPLC系统的检测结果达不到出厂要求或不合格。此时用户会怪罪制造公司，认为是仪器不合格，这实在太不公平。,11,解决上述问题的方法：HPLC生产者应该采取的正确做法：泵、柱、检测器三者联起来检验，三者同时入库（编号），三者成套出售。这样才能保证仪器在用户那里的质量。,12,2、使用者应该对色谱柱及柱外的有关问题引起高度重视（制造者在制造过程中也应该重视）1）色谱峰拖尾：与柱、流动相的流速、试样等有关，发现拖尾一定要从这些方面查找原因；2）如何延长色谱柱寿命：保养很重要，长期不用时用甲醇浸泡着；严格控制洗柱时间或溶剂体积；一般经常使用的柱，下班时应该洗45分钟或洗20倍床体积的溶剂；3）必须注意对“柱外效应”的控制：,13,所谓“柱外效应”,就是指HPLC系统中，除柱系统外，管路、连接件、进样器和流动池的死体积等引起的色谱峰增宽效应。4)进样：自动进样时，应该经常检测自动进样器；对仪器的进样器要求稳定可靠；手动进样时，应该特别注意取样时的细节；进样时的手感（轻、重、缓、急）等。,14,3、HPLC的研发制造者和使用者应该特别注重对色谱柱质量的判断1）色谱柱的柱效：塔板数高者好；特别要注意影响柱效的因素；塔板数降到一定程度该柱就报废了。2）重复性：一根柱子反复使用时，最好RSD能够保持小于0.1%。3）耐用性(寿命)：因为柱效很容易降低，所以需要重视对柱的保护。,15,4）色谱柱使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、阻塞、降低塔板数。一般应该用20倍床体积的溶剂冲洗；隔几天再用的HPLC，最好用20%甲醇：80%水冲洗30分钟左右后，再用纯甲醇冲洗20分钟后保存2。4、HPLC的研发、制造、使用者应该特别重视流动相问题,16,1）PH值特别重要：一般的C18柱在PH值小于3时，容易损坏色谱柱。但是抗酸性的柱可以使用小的PH值。2）注意选择试剂的截止波长2：如乙腈215截止波长215nm、丙酮截止波长330nm、正丁烷210nm等。3）流速：流速要适当，否则影响峰形、浪费溶剂；一般常规分析工作大多选择1ml/min。,17,5、使用者应该注重溶剂前处理最好使用HPLC级的优质溶剂；使用前必须过滤和脱气。注意以下几点：1）过滤目的：溶剂进泵前和样品注射前应该过滤除去溶剂中的微小颗粒、微生物，保证泵和色谱柱不会堵塞或损坏，保证分析数据可靠。,18,2）对过滤器的要求和最佳孔径选择方法：对过滤器总的要求：速度快、溶出度小、死体积小、精确的孔径、体积适当、化学兼容性好等。最佳孔径选择方法：如果色谱柱填料直径小于3m或除菌过滤，一般选择0.2m孔径；如果色谱柱填料直径大于5m，则选0.45m；如果是预过滤或过滤难过滤的样品，一般选1m孔径。特别是对使用无机盐配制的缓冲液，更要注意选择合适的过滤器！否则，不可能得到可靠的分析测试数据！,19,3）脱气：主要目的是：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡；液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。流动相的气泡进入液相泵会引起压力的上下波动，危害很大。必须除之；可以打开排空阀，大流速冲洗。,20,6、使用者应该注重缓冲液问题1）缓冲液使用前必须过滤2）溶剂、样品易受到细菌和霉菌的影响，要注意清洁。3）一般不能直接用有机溶剂做清洗冲洗。4）梯度洗脱时，选低吸收值的缓冲液：,21,例如：梯度洗脱时，缓冲液与有机相应预混，以防止析盐；在保证峰不拖尾的情况下，尽可能选用低浓度的缓冲盐，防止析盐；缓冲盐浓度，一般用2030mM基本上就可以了，如果流动相中有机相含量高的话，流动相中的盐类缓冲液浓度就不能过高，盐的浓度起码要保证在流动相条件下不会析出。离子对缓冲液浓度要高一点，一般50100mM。,22,7、检测器问题1）最常用的检测器主要有四种（紫外、荧光、光蒸发散射和质谱）;紫外检测器覆盖面约70%；荧光检测器覆盖面约12%；蒸发光检测器（包括示差折光检测器）覆盖面约8%左右；质谱8%左右；其它2%）。紫外检测器的波长问题：一般固定254nm或可变波长被常用；但是可变波长较好；2）噪声：直接影响分析误差；应该经常检测之；3）漂移：它是影响稳定性的主要内容内容之一；4）灵敏度（或检测限）：应该经常自己检测，保证HPLC系统的检测限；,23,24,8、特别需要重视使用中的12个常见技术问题（分为：“现象”、“原因判断”、”排除方法”；都是我的经验教训的总结，时间关系，今天我这里只是简单提一下，准备放到分析测试百科网上；供大家参考。）,24,25,25,26,26,27,28,29,30,31,32,33,33,9、结论影响HPLC仪器质量的因素、影响HPLC使用者的分析误差的因素都很多，远不止今天所讲。这就需要制造者、使用者认真学习仪器学理论；因为仪器学理论像一把金钥匙，一通百通；它会使制造者、使用者知其然知其所以然，它可以保证制造者做出优质仪器，可以保证使用者将仪器用到最佳水平、得到最佳分析数据。,34,10、几点体会1）必须打破误区！正确对待进口和国产HPLC仪器！有人迷信进口仪器说：“进口仪器总比国产仪器好”。我说：不对！这是一个误区！过去；都不行！现在；常规、基础、普及型仪器都不错；我国对各类HPLC需求量每年达10000台以上！虽说国产HPLC质量上各有千秋，但是基本上都能满足使用要求！我们要正确评价HPLC仪器！（请参考我的专著）有些高端仪器我国目前还不行，但是高端仪器市场小，赚钱不多；我们要从民族高度看问题！要严防上当！既不要盲目媚外，也不要盲目排外！,35,2）应该大胆使用能满足要求的国产HPLC仪器：今天我国的常规、基础分析仪器不比同类进口仪器差！已经完全可以与国外抗衡（指标优于、相当、不够）。特别是HPLC这类常规仪器，我们国家目前有20多家在生产！虽说仪器的水平、质量等各有千秋！但是，要看到“抗衡”这个问题！我们千万不要迷信进口仪器！今天，我从仪器学理论和分析化学的实践相结合的角度、从使用的适用性角度、从仪器的可靠性和性价比角度等方面，全方位的、负责任的对大家说：目前我国的HPLC这类常规仪器已经可以与国外抗衡了！,36,所以，我再次呼吁：我们要正确评价国产仪器和进口仪器！正确认识国产仪器和进口仪器！正确处理国产仪器和进口仪器的关系！特别是对待HPLC仪器，我们既不要盲目迷信进口！又不要盲目排外！国外好的仪器、我国还不能生产的高端HPLC仪器，我们要引进、要消化、要吸收、要为我所用！国外搞虚假指标欺骗我们的各种仪器，我们要大胆批评！同时我们在打破误区后，还必须要看到差距！中国常规仪器（包括HPLC）与国外的主要差距是：工艺-安捷伦、软件-Waters、附件-DJ）！这样才有赶超的动力！大