分子生物学在检验医学中的应用ppt课件.ppt

1,分子生物学在检验医学中的应用,2,一、分子生物学在检验医学中的常用技术,1、PCR技术2、RT-PCR技术3、RFLP4、SSCP5、MSP6、测序,3,二、外源性疾病的检验与诊断：,1、细菌、支原体、衣原体、寄生虫、病毒等2、SARS冠状病毒的分子生物学检测,4,5,6,BNIoutS/BNoutAs:senseATGAATTACCAAGTCAATGGTTACantisenseCATAACCAGTCGGTACAGCTACFraGmentlenGth195bpBNIinS/BNIAs:senseGAAGCTATTCGTCACGTTCGantisenseCTGTAGAAAATCCTAGCTGGAGFragmentlength110bpSAR1s/SAR1as:senseCCTCTCTTGTTCTTGCTCGCAantisenseTATAGTGAGCCGCCACACATGFragmentlength150bp,7,8,9,10,11,二、内源性疾病的检验与诊断：,1、临床基因变异酶的分子性质研究1）用PCR-SSCP技术发现我国第一例LDH遗传变异病例,12,病例21岁男性：LDH：75U/L(参考范围：110-240U/L)其余指标均正常在三年的调查期间，LDH活力始终处于较低水平，在48-85U/L之间,13,经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的影响等可能因素外，我们怀疑可能有遗传性的LDH变异。根据计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断定为H亚基变异，采用合成的7对引物，分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异发生在外显子4上，由此证明该病人的长期低酶活力是有基因变异引起的。,14,2n23n34n45n56n6,15,2）LDH-A和LDH-B亚基遗传变异及对检验结果的影响,基因变异可导致酶分子组成结构发生变化，对酶活力和酶的物理化学性质造成影响，可给临床医生造成诊断陷阱(pitfall)，因为在不同疾病状态下，从相关联的组织器官中释放出的酶与预期的不同，病人血清酶活力不能完全反映各种疾病的状态，容易造成误诊。,16,LDH-A基因变异类型_变异位置DNA氨基酸置换影响A-171CGA-TGAArg-Ter无义突变A-328GAG-TAGGlu-Ter无义突变A-81GAC-AACAsp-Asn外显子2丢失A-220AAA-GAALys-Glu电荷变化A-314CGT-TGTArg-Cys电荷变化A-20插入C移码突变A-128TGTTGT-TGTValVal-Val辅酶结合A-213丢失2bp(CT)移码突变A-251丢失20bp移码突变,17,LDH-B基因变异类型变异位置DNA氨基酸置换影响B-6AAA-GAALys-Gly电荷变化B-35GCC-GAGAla-Glu辅酶结合B-1038bp重复移码突变B-131AGT-CGTSer-Arg辅酶结合B-139丢失2bp(TC)移码突变B-1454bp重复移码突变B-147TAT-TAGTyr-Ter无义突变B-171CGC-CCCArg-Pro基质结合B-172TTT-GTTPhe-Val基质结合B-173CGC-CACArg-HisP轴的安定性B-176ATG-TTGMet-Leu分子稳定性B-287丢失1bp(C)移码突变B-320GAT-GTTAsp-Val电荷变化,18,3)CK变异的分子性质及对酶活力的影响,病例56岁妇女，胸痛一天后被送入急诊科心电图和临床症状提示AMI实验室检查：LDH6900U/L(200-400U/L)LDH-1/LDH-21.72CK37U/L(15-130U/L)CK-MB0U/L,19,RT-PCR结果,20,21,外显子2残基54处AGGACGGC天冬氨酸甘氨酸位于酶结构的第4个-螺旋,22,4）变异酶人群的检验结果不同于常规人群的检验结果,结合临床研究发现变异酶的检验结果与常人存在着显著的差异，即这类人群发病前酶活力常低于正常人的参考范围，发病时则上升至正常人的参考范围之内，这个现象可能给临床医生正确诊断造成困难；,23,1）2、2、电泳异常带的分子性质研究,24,1）LDH异常电泳酶谱,M4H1M3H2M2H3M1H4(+)LD-5LD-4LD-3LD-2LD-1正常H缺失M缺失H变异(slow)H变异(fast),25,H发生变异时，产生H和hM4H1M3H2M2H3M1H4LD-5LD-4LD-3LD-2LD-1H1M3h1M3H2M2H4h2M2h1H3hHM2h2H2h3H1h4,26,27,28,2）异常电泳酶谱的分子性质,1）核苷酸的变异引起氨基酸的改变，2）变异后的氨基酸的酸碱性与变异前的氨基酸的酸碱性不同，3）变异的氨基酸位于分子的表面。结果：产生异常的电泳结果,29,3）异常谱形的分析方法,30,LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图血清（浆）同工酶分析（异常形式）红细胞、白细胞同工酶分析正常谱型异常谱型免疫对流、固定、混合法鉴定遗传变异（H或M亚基变异）（+）（-）LDH-Ig复合物肿瘤产生LDH基因分析,31,LDHH/M比值的计算,-LDH-1LDH-2LDH-3LDH-4LDH-5H亚基数43210M亚基数01234%ABCDE-计算方法：H=A+3/4B+2/4C+DM=100-HH/M=H/(100H),32,2、后生性调控标志物,33,1、DNA甲基化-后生性调控的主要方式,DNA甲基化是不改变基因序列，而是通过在DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加上甲基，从而调节基因的表达。,34,35,2）启动子甲基化作为新的分子诊断标志物的研究,36,37,3）启动子甲基化在分析LDH异常带分子性质中的首例应用,病例4岁儿童遗传性Rb转移到颈淋巴