分子生物学常用技术PPT课件

.,1,PCR技术,.,2,PCR(PolymeraseChainReaction)Threesteps:denaturation,primerannealing,polymerization.,.,3,ThePCRcycle,95CsteptodenaturetheduplexDNA,Anannealingstepofaround55Ctoallowtheprimerstobind,72Cpolymerizationstep.Mg2+,dNTPsarerequiredinadditiontotemplate,primers,bufferandenzyme,.,4,历史60s-70s：基因的体外分离技术。Khorana（1971）：美国MIT教授、1968年诺贝尔医学奖得主“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。核酸体外扩增最早设想遗忘:当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物；当时(1970)Smith等发现了内切酶，体外克隆基因成为可能,.,5,KaryMullis(1985)发明过程Mullis在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。发展过程：开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。,.,6,专利官司1987年美国专利局专利授权1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属CetusCetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR有关试剂和仪器,.,7,PCR发展速度惊人，没有一种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家MichaelSmith共获,.,8,原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,.,9,procedures,template(DNAorRNA),primers,Taqenzyme,10PCRbuffer,Mg+,5mmol/LdNTPs,pre-denaturation-denaturecompletelyDenaturationannealingElongationcycles:25-30,.,10,PrimerdesignMostimp.(1)length:2030bp(2)G+Ccontents:ATCGrandomdistributed(3)primers:nocomplementarysequence(4)3endoftheprimer:nomodification(5)5endoftheprimer:productlength，canbemodified(6)specificity:lessthan70%homologywithnon-specificamplificationsequence,or8bpcontinuouscomplementarybase,.,11,PrimerdesignedwiththehelpofcomputerDNAdatabaseconservativeregioncomparisionprimersorblast,.,12,PCRreactioncomponentsandtheirfunctionstemplate：ssDNA,dsDNAmRNAneededtobeRTascDNAsamples：fromblood,spermoranyothertissue,fromolderforensicspecimens,fromancientbiologicalsamplesorinthelab.Frombacterialcoloniesorphageplaques.DNA：verystable,.,13,primesIfthePCRproductistobecloned,itissensibletoincludethesequenceofuniquerestrictionenzymesiteswithinthe5-endsoftheprimers.Canamplifyfragmentsover10kbinlengthStore:纯化引物在25乙腈溶液中4；冻干引物于-20可保存1-2年，液体状态于-20可保存6个月。不用时应-20保存。,.,14,buffer10-50mmol/LTris-HCl(pH8.3-8.8,20)。Mg2+：forTaqpolymeraseactivityconc.:Low:lowactivityhigh:non-specificamplificationdNTPs：贮备dNTP液：1mol/LNaOH调pH至中性。贮备浓度为5-10mmol/L，终浓度为20-200umol/L，分装-20保存。4种dNTP浓度应相同。,.,15,TaqDNApolymerase：fromthermophilicbacteria.TaqpolymerasefromThermusaquaticus.otherthermostableDNApolymerasewithgreateraccuracyusedforcertainapplications.mineraloil,.,16,SelectionforDNApolymeraseKlenow酶早期采用该酶不耐热，缺点有温度要求低(37)，受热即失活；产物特异性不高；积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低；扩增的最长序列约400bp（Taq酶则能扩增10kb）,.,17,thermostableDNApolymerasesTaqDNApolymeraseTthDNApolymerasefromT.thermophilusVENTDNApolymerasefromT.litoralisSacpolymerasepfupolymerase,.,18,TaqDNA聚合酶,分离:1969年，美国黄石国家公园温泉分子量:94KDa活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200000U/mg,.,19,TaqDNA聚合酶,离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感。最适浓度为50mmol/L。忠实性:没有校正单核苷酸错配功能-致命弱点。一般出错率为210-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。,.,20,TaqDNA聚合酶,抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂。内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。保存:在-20至少6个月。,.,21,PCRoptimization变性温度和时间92-95，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。退火温度与时间引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55、1-2分钟。延伸温度和时间温度：72，接近Taq酶的最适75时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。循环次数循环过多，非特异性产物大量增加,.,22,PCR污染及其对策强大扩增能力+检测的敏感性极微量的污染便可导致假阳性污染源的追踪点样器和加样器;离心机;微解剖刀;浓缩用具、真空瓶;电泳装置;紫外灯箱;乙醇或水浴锅;冰箱门把手、实验台面等,.,23,污染的预防隔离不同操作区分装试剂改进实验操作专用加样器(5)结果的重演,.,24,PCR技术的应用,.,25,遗传性疾病,地中海贫血的基因诊断血友病苯丙酮尿症,.,26,传染性疾病,肝炎性病肿瘤,.,27,法医学,个人识别、亲子鉴定1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。,.,28,植物遗传育种,构建遗传图谱、分离目的基因、基因定位分子标记辅助育种了解不同品种间的亲缘关系、系统进化,.,29,畜牧,畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异DNA片段构建基因图谱检测基因整合与表达：转基因鱼,.,30,其他考古学植物分类学群体生态学,.,31,DNA芯片技术第一小节概述一、DNA芯片技术的概念DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成（insitusynthesis）寡核苷酸探针，或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。DNA芯片又被称为基因芯片（genechips）、DNA阵列（DNAarray）、cDNA芯片（cDNAchips）、寡核苷酸阵列（oligonucleotidearray）等。,.,32,二、DNA芯片的主要类型及其特点。根据DNA芯片的制备方式可以将其分为两大类：原位合成芯片（syntheticgenechip）采用显微光蚀刻等技术在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片称为原位合成芯片。这种芯片的集成度教高，可达10万40万点阵/平方厘米。但合成的寡核苷酸探针长度较短，一般为820个核苷酸残基（nucleotide，nt），最长为50nt，因此需要使用多个相互重叠的探针片进行检测，才能对基因进行准确的鉴定。DNA微集芯片（DNAmicrochips）将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片称为DNA微集芯片，又称为DNA微集陈列（DNAmicroarray）。这类芯片集成度相对较低，可达1万10万点阵/平方厘米，但使用的探针组的来源比较灵活，可以是合成的寡核苷酸短片段，也可以是采用来自基因组的较长的DNA片段；可以是双链，也可以采用单链的DNA或RNA片段，且技术实现未受到严格的专利控制，因而近年来发展很快。探针的长度可达100500nt。,.,33,第二节DNA芯片技术的基本原理与方法一、芯片的制备芯片制备的基本原理。芯片的制备包括支持物的预处理、原位合成芯片的准备和DNA微集陈列的制备三个方面。1.支持物的预处理目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分为两类：实性材料和膜性材料。实性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜等。实性材料需要进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基等活性基团。在合成寡核苷酸前，这些基因可与光敏材料的光敏保护基团形成共价交联而被保护起来，合成时在光照下除去光敏保护基团，该活性基团又可以和活化的单核苷酸发生化学反应。另一方面，这些活性基团可与DNA分子中的羟基等基团形成共价结合而使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸等，使其带上正电荷吸附带负电荷的DNA探针。,.,34,2.原位合成芯片的制备原位合成芯片是采用显微光蚀刻（photolithography）技术或压电打印（piezoelectricprinting）技术，在芯片的特定区域原位合成寡核苷酸而制成。显微光蚀刻技术也称为光引导聚合技术（light-directedsynthesis），它不仅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。它是照相平板印刷技术（photolithography）与传统的核酸，多肽固相合成技术相结合的产物，是原位合成芯片的主要方法。压电打印法的装置与普通的彩色喷墨打印机相似，所用的技术也是常规的固相合成方法。3.DNA微集陈列的制备DNA微集陈列的制备采用的是预先合成DNA或制备基因探针然后打印到芯片上的方式。,.,35,二、样品的准备样品的准备包括样品的分离纯化、扩增和标记等过程。1样品的分离纯化主要从活组织或血液中获得DNA或mRNA，这个过程包括细胞分离，破裂，去蛋白，提取及纯化核酸的过程。2样品的扩增测定时往往需要较多的样品分子，因此对于分离获得的基因组DNA通过PCR技术直接扩增，对于mRNA则需要逆转录，制备cDNA。3.样品的标记标记物主要有荧光分子（cy3、cy5）、生物素以及放射性同位素等。带有标记的dNTP（cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP）通过DNA或cDNA扩增的过程，掺入靶分子序列。也可以在制备引物时，掺入标记的核苷酸，扩增靶序列后，使扩增产物末端带有标记物。膜性载体可以用于检测同位素标记的样品。样品分子标记的质量影响芯片检测的灵敏度，因此，核酸的提取，反转录以及标记等各环节要求严格操作。荧光标记分辨率高于同位素标记，而且可以采用双色，如对照样品标红色，待检样品标绿色，有助于结果分析与判断。,.,36,三、分子杂交芯片杂交是应用标记的待测样品（靶序列）与固定在载体表面的探针进行的复杂过程。依据探针长度、类型以及不同的目的，确定温度、盐浓度与反应时间。通常采用的条件是：42，50%甲酰胺，6SSC，0.5%SDS，5Denhardt试剂。也可采用65，6SSC，0.5%SDS，5Denhardt试剂或者65，10%SDS，7%PEG-800。杂交过程类似Northern或Southern杂交，如封闭液预杂交、杂交、清洗、干燥与检测。四、检测分析芯片杂交信号的检测可应用荧光检测法、质谱法、化学发光法、光导纤维法以及生物传感器法。其中激光共聚焦荧光检测法是最常应用的方法：激光从芯片的背面切入，聚焦于芯片与靶溶液的相互作用面，与探针杂交的靶序列标记物被激发产生荧光，经过棱镜聚焦而被检测器检测。样品靶序列与探针严格配对杂交的分子发生强荧光信号，不完全杂交显示较弱的信号。,.,37,第三节DNA芯片技术的应用DNA芯片使用的基本流程。DNA芯片使用包括待测样品准备、分子杂交和检测分析3个步骤。1.待测样品的准备样品的准备包括样品的分离纯化、扩增和标记。首先采用常规方法从组织细胞中分离纯化样品核酸、DNA或mRNA，由于目前芯片检测仪器的灵敏度有限，要求对样品中靶序列进行高效而特异地扩增。样品的标记主要采用荧光法，也可以用生物素，放射性核素标记法。2.分子杂交待测样品经扩增和标记处理后，即可与DNA芯片上的探针陈列进行分子杂交。芯片杂交与传统的Southern印迹等杂交方法类似，属固-液杂交。探针分子固定于芯片表面，与位于液相的靶分子进行反应。芯片杂交的特点是探针的量显著大于靶基因片段，杂交动力学呈线形关系。杂交信号的强弱与样品中靶基因的量成正相关。3.检测分析芯片杂交及清洗后，未杂交分子被清除，带有荧光标记的靶DNA（杂交分子）与其互补的DNA探针形成杂交体，在激光的激发下，荧光素发射荧光。以扫描仪对荧光信号进行检测和分析，通过陈列上DNA探针的原始序列将靶DNA的信息反映出来。,.,38,DNA芯片技术在医学领域的应用DNA芯片用于基因诊断、DNA序列测定、临床药物筛选、法医鉴定、食品工业和环境监测等方面。在医学领域具有极大的潜力。1.基因诊断应用DNA芯片技术可以在DNA水平检测与疾病相关的内源性或外源性基因；应用表达芯片可以在mRNA水平分析同一组织在不同的发育阶段，正常及病理状态基因表达的差异，也可以分析不同组织同一基因在正常及病理状态下表达的差异，从而为疾病诊断与分类，病原微生物分型提供科学依据。2.DNA序列测定任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解成一系列碱基数固定、错落而且重叠的寡核苷酸，如GTACTCGAATGC分解成GTACTAGA、TACTCGAA、ACTCGAAT、CTCGAATG、TCGAATGC五个错开1个碱基但是可重叠7个碱基的8体亚序列，当然也可以分解成7体，9体或其他整数（n体）亚序列。如果用某种方法将5个亚序列全部测定出来，就可以重新组建原来的核苷酸排列顺序。应用这一原理，可以合成或应用已知序列的所有可能的n体寡核苷酸，并将其固定在芯片表面，然后与标记的待测靶序列杂交，经过重新组合，即可得到待测的DNA序列。3.临床药物筛选临床许多细菌对药物具有抗药性，但是不同的亚型对同一药物的敏感性不同。DNA芯片技术已被用于鉴定结核菌及非典型分支杆菌的基因型与耐利福平的相关性以及HIV产生抗药性与其逆转录酶及蛋白酶基因突变的相关性。这为临床选择敏感药物提供了有效手段。4.其他领域法医鉴定、食品工业、环境监测等方面，DNA芯片技术也将具有极大的潜力。,.,39,核酸分子杂交技术第一节核酸分子杂交的基本原理,具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。杂交有固一液相杂交和液相杂交。,.,40,.,41,一、DNA变性与复性,（一）DNA变性1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性,.,42,2、变性的方法：（1）热变性：温度升高到90100时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。,.,43,3、变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加,.,44,4、GC含量与Tm值之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3)2.44Tm=(G+C)%0.41+69.3,.,45,（二）复性1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。,.,46,2、复性过程（1）单链分子间碰撞形成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子,.,47,二、影响杂交的因素1、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.10.5g,浓度过高影响杂交效率,.,48,2、温度：（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低2025（2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5,.,49,3、离子强度：（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度,.,50,4、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在3542杂交（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68杂交,.,51,5、非特异性杂交反应：（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉,.,52,第二节核酸分子杂交的方法按待测核酸是否固定在固相支持物上分：固-液相杂交膜上印迹杂交原位杂交液相杂交RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法,.,53,一、Southern印迹杂交（一）待测核酸样品的制备1、裂解或破碎细胞2、抽取纯化基因组DNA3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段,.,54,（二）待测DNA样品的电泳分离1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶分离小片段用高浓度胶2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小相同的分子处于同一条带3、分子量标准：经Hind消化的DNA，杂交所用分子量标准可用核素标记,.,55,（三）凝胶中核酸的变性（碱变化）凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液,.,56,（四）Southern印迹指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程,.,57,1、固相支持物的选择（1）理想的固相支持物应具备的特性具有较强结合核酸分子的能力不影响与探针的杂交反应与核酸分子结合稳定牢固具有良好的机械性能非特异吸附少,.,58,（2）常用的固相支持物硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本底低。缺点是DNA分子结合不牢固尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能力较上述两种膜低,.,59,2、Southern印迹的常用方法（1）毛细管虹吸印迹法,利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上,.,60,（2）电转法,利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。,.,61,（3）真空转移法,此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。,.,62,（五）Southern杂交1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交液为不含DNA探针的杂交液2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA,.,63,（六）杂交结果检测1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针,.,64,（七）Southern杂交在医学中的应用1、酶切图谱分析2、特定基因定性和定量3、基因突变分析4、限制性片段长度多态性的分析,.,65,二、Northern印迹杂交1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同2、鉴别RNA3、探针可用DNA或RNA片段4、待测样品为总RNA或mRNA,.,66,Northern印迹与Southern印迹的不同点1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理3、靶核酸为RNA,.,67,三、斑点及狭缝印迹杂交1、斑点印迹为圆形2、狭缝印迹为线状3