蛋白质的结构(dl)PPT课件

-,1,（四）超二级结构和结构域,近年来在研究蛋白质构象、功能和进化的变化时，发现在蛋白质二级结构和三级结构之间存在着两个过渡层次，即超二级结构和结构域。,-,2,1、超二级结构,多肽链内若干顺序上相邻的二级结构的构象单元在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构的组合体。超二级结构在结构层次上高于二级结构，但不具有功能。超二级结构的形式主要有：-螺旋组合（）；-折叠组合（）；-螺旋-折叠组合（）；希腊钥匙结构,超二级结构类型：,-,4,2、结构域,多肽链在超二级结构的基础上进一步的盘绕折叠成紧密的近似球状的结构，在空中彼此分隔，相互独立，结构域之间通过共价的、松散的肽链相连（铰链区）。对于有些较小的蛋白质分子，结构域和-三级结构是一个意思，即这些蛋白质分子是单结构域的。,-,5,back,（五）蛋白质三级结构：,1、概念,包括主侧链在内的所有原子在三维空间的排列。一条多肽链在二级结构的基础上，由于顺序上相隔较远的氨基酸残基侧链的相互作用，进行范围更广泛的盘绕、折叠，形成很不规范但特定的空间构象。,具有三级结构的蛋白质分子，往往具有球形、椭球形的物理外形，称之为球蛋白。球蛋白常常是生物体内具有一定生理功能的活性蛋白质。例如：肌红蛋白（Mb）;核糖核酸酶；细胞色素C；,2、稳定三级结构的作用力,氢键疏水力（疏水作用力）范氏引力（分子间的作用力）离子键（盐键）酯键二硫键,Garrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.181,三级结构中的氢键,ahelix,bsheet,Garrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.181,胰脏trypsininhibitor,三级结构中的离子键,可与金属离子形成离子键：Cys,His,Glu,Asp,金属离子对蛋白质的贡献：(1)稳定蛋白质的结构(2)参与蛋白质的功能,三级结构中的疏水作用力,疏水性氨基酸基团,以水溶性蛋白质而言(脂溶性蛋白质恰相反),Albertsetal(2002)MolecularBiologyoftheCell(4e)p.135,亲水性基团,三级结构中的二硫键,AdaptedfromAlbertsetal(2002)MolecularBiologyoftheCell(4e)p.152,分子內,分子间,Oxidation,Reduction,3、球蛋白分子结构的一般特征,一条肽链往往是通过一部分-螺旋，一部分-折叠，拐角处形成-转角或无轨卷曲盘绕折叠成致密的球形分子具有极性侧链的氨基酸残基几乎分布在分子的表面亲水的表面而非极性氨基酸侧链的残基包埋在分子的内部形成疏水的核分子表面往往有一个裂隙（口袋；凹槽），常常是疏水的环境。这一部位常常是球蛋白的活性部位,-,15,Hexokinase具有两个结能域,Albertsetal(1994)MolecularBiologyoftheCell(3e)p.196,细胞色素C的空间结构,4、肌红蛋白的结构,肌红蛋白是哺乳动物肌肉中运输氧的蛋白质。是1957年由JohnKendrew用X射线晶体分析法测定的有三维结构的第一个蛋白质。由153个氨基酸残基组成的一条多肽链。分子内含有一个血红素辅基。相对分子量17800d,血红素分子,His,2+,（六）蛋白质的四级结构,1、寡聚蛋白和蛋白质亚基,分子量较大的蛋白质往往由两条或两条以上的多肽链组成，这些肽链相互之间以非共价键结合，每条多肽链各自具有一定的三级结构，但肽链单独存在时不具有生物活性，这种肽链就称为蛋白质的亚基,亚基聚合在一起形成具有一定生物学功能的蛋白质分子寡聚蛋白,-,21,2、蛋白质的四级结构,寡聚蛋白质中亚基的空间排布、相互关系和相互作用力，称之为蛋白质的四级结构。亚基的种类和数量均一四级结构不均一四级结构亚基的空间排布亚基间的相互作用力次级键,-,22,3、血红蛋白的四级结构,Hb分子量为65000dHb是由2条链和2条链组成的四聚体。链由141个氨基酸组成，链由146个氨基酸组成，各自都有一定的氨基酸排列顺序。两种亚基的一级结构差别较大，但它们的二、三级结构却大致相同，而且与肌红蛋白极为相似。,Hemoglobin,Myoglobin,Mathewsetal(2000)Biochemistry(3e)p.214,血红蛋白的四级结构,-,24,五、蛋白质结构与功能的关系,蛋白质分子具有多种多样的生物功能是以其极其复杂的结构为基础的。这不仅需要一定的化学结构，更重要的是需要特定的空间结构作基础。研究蛋白质结构与功能之间的关系是分子生物学的一个重要方面。,-,25,（一）一级结构与功能的关系,-,26,1、分子病,分子病（moleculardisease)：是一种遗传性疾病，由于DNA分子上基因突变，而合成了失去正常生物活性的异常蛋白质，或者是缺失某种蛋白质，从而影响了机体正常的生理功能而产生的疾病。研究表明几乎所有遗传病都与pr分子结构改变有关。,-,27,镰刀型红细胞贫血病是1904年首先被发现的一种分子病。病人的血红蛋白（Hb-S）与正常人血红蛋白（Hb-A）相比，链第6位氨基酸不同。HbAVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-HbSVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-仅仅这一点差别，就使患者的红细胞在氧缺乏时呈镰刀状，易胀破发生溶血，运氧机能降低，引起头昏、胸闷等贫血症状。,-,29,Mathewsetal(2000)Biochemistry(3e)p.239,-,30,2、种属差异与分子进化,同源蛋白质：不同种属中完成相同功能的蛋白质。对于不同种属来源的同种pr进行一级结构测定和比较，发现存在种属差异。这种差异可能是分子进化的结果。比较种属来源不同而功能相同的同源pr的一级结构，发现与活性和pr空间结构密切相关的aa残基高度保守。,-,31,-,32,（二）酶原与激素原的激活,1.胰岛素原的激活,-,33,2.蛋白水解酶原的激活,消化道中蛋白酶原激活的连锁反应：,胰凝乳蛋白酶原,胰凝乳蛋白酶,弹性蛋白酶原,弹性蛋白酶,羧肽酶原,羧肽酶,-,34,一级结构是空间构象的基础蛋白质的空间构象归根到底是由一级结构决定一级结构与功能的关系是十分重要的一级结构与功能的关系实际上反映的也是高级结构与功能的关系,-,35,（二）蛋白质高级结构与功能的关系,蛋白质的构象并不是固定不变的。别构现象：有些蛋白质表现其生物活性时，其构象发生改变，从而改变整个分子的性质，这种现象叫别构现象。血红蛋白在表现其输氧功能时就具有别构现象。,(R)relaxedstate,(T)tensestate,Hemoglobin,氧分子,Myoglobin,环境氧浓度高时Hb快速吸收氧分子,环境氧浓度低时Hb迅速释出氧分子,任何一个亚基接受氧分子后，会增进其它亚基吸附氧分子的能力,-,37,氧结合曲线（氧解离曲线）,一级结构(氨基酸序列)二级结构(helix,sheet)三级结构(monomer)四级结构(dimer),序列构象活性调节,Domain(结构域),JuangRH(2004)BCbasics,蛋白质各级结构的意义,-,39,两性解离高分子量性质胶体溶液性质蛋白质的沉淀蛋白质的变性和复性,五、蛋白质的性质,-,40,（一）蛋白质是两性电解质：,(1)蛋白质具有酸碱两性(2)蛋白质的可解离基团：肽链末端的-氨基和-羧基辅基部分包含的可解离基团侧链上的可解离基团：-氨基，-羧基，-羧基，咪唑基，胍基，酚基，巯基,-,41,(3)蛋白质的等电点(PI)：蛋白质以兼性离子存在时，溶液的pH值，就是蛋白质的等电点。,-,42,含碱性氨基酸残基较多的，pI偏碱，反之，偏酸。含酸碱氨基酸残基数目相近者，等电点为中性偏酸。如鱼精蛋白：pI=1212.4如胃蛋白酶：pI=12.5胰岛素：pI=5,-,43,等电沉淀：蛋白质分子在等电点的溶液中，溶解度最低，最容易从溶液中析出，用这种方法沉淀蛋白质，称为等电沉淀。,(4)利用蛋白质两性性质可分离纯化蛋白质,-,44,蛋白质电泳：,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。,-,45,电泳,自由界面电泳,区带电泳：纸电泳，凝胶电泳、醋酸纤维薄膜电泳,-,46,几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,-,47,-,48,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,-,49,有一混合蛋白质（其pI值分别是4.6，5.0，5.3，6.7，7.3）溶液，电泳时欲使其中四种泳向正极，缓冲液pH应该是多少？A.4.0B.6.0C.7.0D.8.0,-,50,在pH7时，下列蛋白质电泳的方向和相对应位置图示之。胰岛素（5.3），核糖核酸（9.5）胃蛋白酶（PH=1.0）细胞色素C（PI=10.7）血红蛋白（PI=6.7）,+,pHpI,Pro+ProPro-,点样点,-,51,（二）蛋白质的高分子化合物性质,蛋白质是分子量很大的生物大分子（104106d或更大），蛋白质的很多性质与其分子量有关。,-,52,测定蛋白质分子量的方法有：,根据化学组成测定最低相对分子量,利用蛋白质的物理化学性质来测定,渗透压法,超离心法,凝胶过滤法,凝胶电泳法,-,53,1、根据蛋白质的化学组成测定最低相对分子量,采用化学分析的方法，测定蛋白质分子中某一微量元素的含量。假定蛋白质分子中只含有一个这种被测定元素的原子，则可以计算出蛋白质最低相对分子量。,如:肌红蛋白，Fe含量为：0.335%。,-,54,如:血红蛋白,Fe含量为：0.335%，计算其最低相对分子量也是16700，但根据其它方法测得的分子量是68000。,n代表被分析元素的原子个数。,-,55,如:牛血清清蛋白含色氨酸0.58%，计算所得的最低相对分子质量是35200；每一个牛血清蛋白分子含两个色氨酸分子，则真实分子量是69000。（色氨酸的分子量为204）,-,56,该方法的优点：计算所得的真实分子量十分精确。缺点：必须和其它方法结合使用，否则不能提供真实分子量。,-,57,2、超速离心法：SedimetationVelociy,采用分析性超速离心机（转速大，5000060000rpm，配有光学系统，观察离心情况）利用光学方法测定界面移动速度（用S表示），分子量越大，界面移动就越快。,-,58,S沉降系数(sedimentationcoefficient,S)，代表大分子物质在超速离心时单位离心力场的沉降速度，与蛋白质的大小和形状有关。其数值定为110-13秒，分子越大，沉降越快，其S值就越大。,-,59,R-气体常数T-绝对温度D-扩散系数V-溶质分子的密度倒数-介质的密度S-沉降系数,-,60,沉降速度法优点：操作时间短，还可以鉴定纯度（均一的蛋白质溶液仅形成一个界面，而不同分子量的混合物形成几个界面）缺点：需要参数多,-,61,3、凝胶过滤法分子排阻层析技术（分子筛法）,这是根据分子大小分离、测定蛋白质混合物的一种方法（柱层析）,-,62,填充物：萄聚糖凝胶,sephadex,高度水化的惰性物质具有不同网眼大小合成凝胶,借助重力过柱：,比网眼大的分子不能进入网眼中比网眼小的分子进入网眼中,过柱时，所走的路程不同,大分子先下来小分子后下来,-,64,（三）蛋白质的溶液是胶体溶液,1、胶体溶液：以固体物质做分散相，液体做分散剂的分散系。,粗分散系：100nm，不稳定。胶体：100nm分散颗粒1nm，相对稳定。真溶液：分散颗粒1nm，稳定。,分散系是一种物质以或大或小的颗粒分散到另一种物质中去所得到的体系，它包括分散相和分散剂。根据分散相、分散剂的状态，可构成9种分散系。其中最常见的是分散相为固体、分散剂为液体的系统，又根据分散颗粒的大小，可分为三种分散系：,-,65,2.维持亲水胶体稳定性的因素：,颗粒大小：1nm100nm,质点带有相同电荷,质点与溶剂相结合，形成溶剂化层（水化层）,3.蛋白质的水溶液是胶体溶液,-,66,蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）；2）带相同电荷。,-,67,（四）蛋白质的沉淀反应：,分离、纯化蛋白质时，常需要进行蛋白质沉淀,凡是影响蛋白质胶体溶液稳定因素的措施，都可用于沉淀蛋白质。,pH值：（改变界质酸碱度）,pH=pI时溶解度最小，蛋白质沉淀,高浓度的中性盐离子强度,盐溶：盐析：,-,68,-0.2,0,0.2,0.4,0.5,1,1.5,2,低浓度时，盐浓度溶解度盐溶,高浓度时，盐浓度溶解度盐析,实际是离子强度的影响。（同样浓度的二价中性盐比单价盐影响大）,pI时，K2SO4对碳氧Hb溶解度的影响,-,69,有机溶剂（脱水剂）：如乙醇、丙酮等。,重金属离子（Hg2+、Ag+、Pb2+、Cu2+）,生物碱试剂：如三氯乙酸、苦味酸、单宁酸、磷钨酸等。,-,70,（五）蛋白质的变性与复性,蛋白质受物理或化学因素影响，其分子内部原有的高度规律性结构发生变化，致使蛋白质分子的理化性质和生物学性质都有所变化，但并不导致其一级结构的破坏，这种现象叫蛋白质的变性。变性后的蛋白质叫变性蛋白质。,1.什么叫变性(denaturation),-,71,2.变性实质变性实质最早由我国科学家吴宪发现(1931年)。在变性因素影响下，破坏了维持高级结构的次级键和二硫键，蛋白质分子从原来有序卷曲的紧密结构变为无序的松散结构。但一级结构没有破坏，组成成分和分子量都不变。,-,72,3.变性因素物理因素：加热（70100）、高压、剧烈振荡