（医学PPT课件）抗原抗体反应与非标记免疫分析

第一节抗原抗体反应原理第二节检测抗原和抗体的体外试验第三节免疫细胞功能的测定,抗原抗体反应与非标记免疫分析,1,第一节抗原抗体反应原理,（一）抗原抗体反应的机理抗原决定簇和抗体分子超变区之间的结构性互补结合，只能发生在极短距离内1.亲水胶体转化为疏水胶体,抗体和大多数抗原同属蛋白质。在通常的血清学反应条件下均带有负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体，因此蛋白质不会自行凝集出现沉淀。当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化层变薄;而且由于抗原抗体复合物形成后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体。此时在电解质(如NaCl，的作用下，使各疏水胶体之间进一步靠拢、沉淀，形成可见的抗原抗体复合物。,2,2.抗原抗体结合力静电引力范德华力氢键疏水键,3,静电引力,抗原和抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互的引力，称为静电引力，又称库伦引力。例如，抗体分子上带电荷的碱性氨基酸的游离氨基(-NH3+和酸性氨基酸的游离羧基(COO-可与抗原分子上带相反电荷的对应基团相互吸引。这种引力的大小与两个相互作用基团间的距离的平方成反比。,4,范德华引力,抗原和抗体相互接近时，由于分子的极化作用而出现的引力，称范德华引力。结合力的大小与两个相互作用基团的极化程度的乘积成正比、与它们之间距离的7次方成反比;键能约为4.2-125kJ/mol。这种引力的能量小于静电引力。,5,氢键结合力,供氢体上的氢原子与受氢体原子间的引力。在抗原抗体反应中，羧基、氨基和羟基是主要供氢体，而羧基氧、羧基碳和肽键氧等原子是主要受氢体，能的大小取决于方向即氢键具有高度的方向性，因此比范德华力更具有特异性。氢键结合力与供氢体和受氢体之间距离的6次方成反比，键能约209kJ/mol。,6,疏水作用力,两个疏水基团在水溶液中相互接触时，由于对水分子排斥而趋向聚集的力称为疏水作用力，或称为疏水键。当抗原抗体反应时，抗原决定簇与抗体上的结合点靠近，互相间正、负极性消失，由静电作用形成的亲水层立即失去，从而促进抗原与抗体的相互吸引而结合。疏水作用力在抗原抗体反应中的结合是很重要的。提供的作用力最大，约占总结合力的50%。,7,8,第一节抗原抗体反应原理,(二)抗原抗体反应的特点高度特异性特异性越强，亲和力也越高；表面化学基团之间的可逆结合不如共价键稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性；,Ab+AgAb:Ag,9,(二)抗原抗体反应的特点,3.适宜的抗原抗体浓度和比例（定比性）决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应；4.抗原抗体反应的2个阶段性第1阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完成；第2阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。,(二)抗原抗体反应的特点,10,11,等价带,12,(三)抗原抗体反应的影响因素抗原和抗体自身的因素可溶抗原沉淀颗粒抗原凝集单价抗原不可见反应粗糙细菌生理盐水自凝,抗原抗体反应原理,13,2.环境影响因素,电解质在中性或弱碱性条件下表面带有较多负电荷盐促进沉淀或凝集物的生成；温度常为37，提高反应温度可增加抗原抗体分子碰撞机会56变性失活；一般反应15-40；酸碱度pH值6-8当pH值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。,14,常用免疫分析技术概述,15,免疫反应的形式,均相与非均相反应直接与竞争反应,16,特异性,结合力的表示方法,亲和力和亲合力,Ag-Ab反应的原理,17,Ag-Ab反应的可见性,18,：,1、抗原结合价必须在2价以上；2、抗体结合价也必须是2价或2价以上；3、抗原抗体能形成复合物但不一定能形成沉淀；4、抗原抗体结合形成大分子凝集物的前提是要求其结合价彼此饱和；5、当抗原大大过量时，只有溶解状态的抗原抗体复合物，而无沉淀出现，在免疫检测中称为前带现象。,抗原抗体凝集（沉淀）反应形成的特点,19,第二节免疫凝集反应,细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。,一、直接凝集,20,直接凝集反应,1:2稀释待测血清1:41:81:16,玻片法,试管法,常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定,常用于检测抗体的滴度或效价，见于临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验。,21,二、间接凝集反应,将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。,22,1.正向间接凝集试验抗原致敏载体如检测IgM2.反向间接凝集试验抗体致敏载体如检测乙肝表面抗原，甲胎蛋白等,间接凝集反应,23,3.间接凝集抑制试验抗原致敏载体与抗体为检测试剂,4.协同凝集反应,24,协同凝集,+,病人的RBC,体内anti-Rh,由于抗体多属于IgG，分子量较小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排斥力，不出现凝集,+,Y,体外加入抗人IgG,出现凝集现象，叫直接库姆试验,25,三、间接血凝试验,红细胞为载体1.红细胞载体的致敏红细胞载体的醛化甲醛、戊二醛、丙酮醛载体的致敏2.间接血凝试验检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产生的抗体固相间接血凝自身红细胞凝集,26,一、液相内沉淀反应1.环状沉淀试验2.絮状沉淀试验,第三节沉淀反应,毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。,27,滴定方阵,28,抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。1.直接比浊测定法透射比浊散射比浊缺点大量过剩，可溶性复合物；维持抗体蛋白量始终过剩；脂蛋白小颗粒。,二、免疫浊度试验,29,三、凝胶内沉淀反应,1.单向免疫扩散,用于确定抗原浓度,30,31,2.双向免疫扩散,32,鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同,33,四、沉淀反应免疫电泳,存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性质。,34,35,第四节补体结合与中和试验,一、补体结合试验,36,二、中和反应,中和反应（neutralization）是指毒素、酶、激素或病毒等与其相应的抗体结合后，导致它们的生物活性丧失的反应。凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体称为中和抗体；能与细菌外毒素结合，中和其毒性作用的