响应面法优化微波提取柚皮总黄酮工艺论文.doc

响应面法优化微波提取柚皮总黄酮工艺论文1 实验材料与方法1.1 实验材料：蜜柚，九成熟（市售）、芦丁（中国药品生物制品检定所提供）；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠均为优级纯；二次蒸馏水1.2 主要仪器设备：FA2004型电子天平（上海精科）；722-1 型电热恒温干燥箱（湖北省黄石市医疗器械厂）；HK-04A200 g手提式粉碎机（广州旭朗机械设备）；WD900ASL23-2 型微波炉（格兰仕）；SHZ-III 循环水多用真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；722型可见分光光度计1.3 实验方法1.3.1 实验材料的预处理 柚皮洗净切片50 干燥冷却粉碎过40目筛制得柚皮粉。1.3.2 芦丁标准曲线及回归方程 精确称取芦丁对照品0.01g用80%乙醇溶解，定容于100ml容量瓶中，配制成0.1g/L的芦丁对照品溶液。准确移取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml的芦丁对照品溶液于10ml容量瓶中，用乙醇补充至3.0，加入5%亚硝酸钠溶液0.5ml，摇匀后放置6min，然后加入10%硝酸铝溶液0.5ml，摇匀后放置6min；最后加入1mol/L氢氧化钠溶液4ml，用80%乙醇补充至刻度，摇匀后放置15-20min，以相应试剂做空白，于510nm处测定吸光度，制作芦丁标准曲线，线性回归得到吸光度A与黄酮质量浓度的方程：A=12.136c0.0045，相关系数R=0.9980.1.3.4 微波法提取总黄酮的方法 称取1.00 g柚皮粉于锥形瓶中，加入80%乙醇溶液35 mL，在解冻档下微波处理6 min (每次加热2min，放置1 min，累计达6 min) ，过滤，定容至100 mL。采用硝酸铝比色法，在510 nm处测定吸光度，计算总黄酮得率。1.3.5 总黄酮类物质的测定按以上方法用提取液代替芦丁实验，利用回归方程进行计算即可。 X =m1V2Dm 100 %式中 X样品中总黄酮含量，mgmL； m1根据标准曲线计算出待测液中黄酮的量，mg； m 样品质量，g； D 样品的总稀释倍数；V2 样品提取液总体积，mL。2 结果与讨论2.1微波法提取总黄酮工艺条件单因素试验设计2.1.1 乙醇浓度对总黄酮提取效果影响称取5份1. 00 g柚皮粉分别置于锥形瓶中，在料液比固定在1:35、提取时间为5min，解冻档的条件下，分别对柚皮粉按以下不同乙醇浓度50%、60%、70%、80%、90%进行微波提取，布氏抽滤，滤渣以同样的条件提取、抽滤，合并滤液，然后用相应浓度的乙醇水溶液定容至50mL，按照制作标准曲线的方法得出柚皮中总黄酮的提取率，结果见图1。 图1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响 由图1可知，随着乙醇浓度的增加，总黄酮的提取率也在升高，在乙醇浓度为80%时达到最大值，但当乙醇浓度继续增大时，提取率下降，因此乙醇浓度为80%左右为宜。2.1.2 料液比对总黄酮提取效果的影响称取5份1.00 g柚皮粉分别置于锥形瓶中,在乙醇浓度固定在80%、提取时间为5min，解冻档的条件下，分别对柚皮粉按以下不同料液比1:20、1:25、1:30、1:35、1:40进行微波提取，方法同上，得出总黄酮提取率，结果见图2。图2 料液比对总黄酮提取率的影响由图2可以看出，在液料比为1:20到1:35 增加的过程中，总黄酮的得率随液料比的增大升高，液料比1:35是达到最大，随后提取率下降，因此选取1:35较为合适。 2.1.3 提取时间对总黄酮提取效果的影响称取5份1.00 g柚皮粉分别置于锥形瓶中, 在乙醇浓度固定在80%、料液比为1:35的条件下，分别对柚皮粉按以下不同提取时间3、4、5、6、7min进行微波提取，方法同上，得出总黄酮提取率，结果见图3。图3 提取时间对总黄酮提取率的影响 由图3 可以看出, 开始时总黄酮得率随提取时间的延长而升高,当提取时间达到6min时，总黄酮得率达到最高，之后随时间继续延长，总黄酮得率不再提高反而略有下降，因此选择提取时间为6min为宜。2.2 中心实验设计与响应面分析采用软件Design-Expert 8.0中的Box-Behnken试验设计原理14，在乙醇浓度、料液比、提取时间3个因素对柚皮总黄酮提取率的研究的基础上，综合单因素试验结果，采用响应面分析法在3因素3水平上，以乙醇浓度、料液比、提取时间3个因素为自变量，柚皮总黄酮提取率为响应值进行优化，以达到最大限度提取柚皮总黄酮的目的。试验因素与水平设计表见表1，响应面试验方案及结果见表2。表1 Box-behnken实验设计因素与水平水平因素乙醇浓度%(A)料液比( g :mL)(B)提取时间min(C)-1701:3050801:3561901:407表2 Box-Behnken中心组合设计方案及实验结果实验号A:乙醇浓度%B:料液比 C:提取时间min Y:总黄酮得率%1-1.001.000.000.364 21.001.000.000.36531.000.001.000.43940.000.000.000.57850.000.000.000.57760.000.000.000.57571.000.00-1.000.4348-1.00-1.000.000.36891.00-1.000.000.372100.00-1.00-1.000.45111-1.000.001.000.432120.000.000.000.57413-1.000.00-1.000.436140.001.00-1.000.446150.000.000.000.576160.00-1.001.000.449170.001.001.000.4452.3 回归模型分析采用Design expert 8.0软件对表2中的数据进行多项式拟合回归，以总黄酮提取率（Y）为因变量，乙醇浓度（A），料液比（B）和提取时间（C）为自变量，建立多元二次响应面回归模型:Y=0.5760+0.0125A+0.0225B+0.0225C-0.075AB+0.0225AC+0.025BC-0.11A2-0.098B2-0.03C2由表3可知，一次项中乙醇浓度、提取时间以及交互项中乙醇浓度和料液比的交互作用对总黄酮得率均有显著的影响(P 0.05)，料液比、乙醇浓度和提取时间的交互作用对总黄酮得率有显著影响(P 0.05)。根据多元二次回归方程的各个系数绝对值的大小可判断三个因素对提取率的影响顺序为料液比提取时间乙醇浓度。模型P=0.0004 FModel 0.1090.0126508.92 0.0001 A 1.250E-00511.250E-0057.00 0.0331 * B 5.000E-00515.000E-00528.00 0.0011* C 5.000E-007 1 5.000E-00 70.280.6131 AB 2.250E-00612.250E-0061.260.2987 AC 2.025E-00512.025E-00511.340.01208 BC 2.500E-00712.500E-0070.140.7194 A2 0.05210.05228855.66 0.0001* B2 0.04110.04122703.03 0.0001* C2 3.821E-00313.821E-0032139.83 0.0001* 残差 1.250E-00571.786E-006 失拟项 2.500E-00638.333E-0070.330.8032 净误差 1.000E-00542.500E-006总离差 0.1016注：*表示P0.001，差异极显著；*表示P0.05，差异显著；2.4 交互作用响应面图能比较直观的反映各因素和各因素间的交互作用，通过多元回归方程做响应面图，见图4 6。图4 Y=f（A，B）的响应面图和等高线图图5 Y=f（A，C）的响应面图和等高线图图6 Y=f（B，C）的响应面图和等高线图由图4图6 可以看出，3 个响应曲面均为开口向下的凸形曲面，同时等高线最小椭圆的中心在所选的-11 范围内，说明响应值（柚皮总黄酮得率）在3个因子设计的范围内存在最大值。由图4 显示可知在料液比大时，总黄酮提取率随着乙醇浓度的增加而增大，但达到一定程度后，总黄酮提取率呈现下降趋势，这说明在不同的料液比条件下，乙醇浓度对总黄酮提取率的影响也不同。由图5显示可知，总黄酮的提取率随提取时间与乙醇浓度的增加先增加后减小。由图6 显示可知，在一定的时间内，总黄酮提取率随料液比的增大而增大，但达到一定程度时，总黄酮提取率随料液比的增大而减小。由此得知：A（乙醇浓度）和B（料液比）交互效应较显著，A（乙醇浓度）与C（提取时间）交互作用极显著，这与方差分析的结果相吻合。 因此，由响应面法分析得到的柚皮中总黄酮提取的最佳工艺条件为：乙醇浓度81.4%，料液比1:33.2，提取时间6.13min，此时柚皮中黄酮的理论提取率达到了0.5825%。2.5 验证实验为了验证响应面法的可靠性，采用得到的最佳提取工艺条件进行生姜总黄酮提取的验证实验，同时考虑到实际生产操作的便利性，选取以乙醇浓度81%，料液比1:33，提取时间6min为最佳。在响应面分析法求得的最佳条件下对生姜总黄酮进行三次平行实验，生姜总黄酮平均提取率为0.579%，与理论值相对误差为0.0045%，验证值与回归方程所预测值相吻合得很好，表明响应面法对柚皮总黄酮进行提取的研究是合理可行的，具有实际生产价值。3 结论（1）在单因素实验的基础上，将响应面法应用于优化微波法提取生姜总黄酮的条件。回归分析结果表明，乙醇浓度、液料比和提取时间对总黄酮提取率的影响显著；提取过程中乙醇浓度和料液比的交互效应对总黄酮提取率影响极显著，乙醇浓度和提取时间对生姜总黄酮提取率的影响较显著。（2）生姜总黄酮提取率响应方程的回归分析和验证试验表明此方法合理可行。得到从生姜中微波法提取总黄酮最佳条件为：提取溶剂中乙醇浓度为81 %，料液比为1:33，提取时间为6 min，总黄酮提取率预测值为1.002 %，验证值为0.579%，与预测值的相对误差为0.0045%。因此采用响应面法优化的总黄酮微波法提取工艺条件，对于柚皮的综合利用以及黄酮类化合物的产业化具有一定的理论参考。参考文献1 胡春,丁宵霖.黄酮类化合物的构效关系的研究J. 食品与发酵工程, 1996, 22(3) : 46-53.2 郑诚乐, 许伟东, 潘东明. 姜酚的正交试验法测定雄粟总黄酮含量技术研究J.中国农学通报, 2009, 25(1) :128-13.3 陈维, 李伟, 天然黄酮苷的药理活性及合成研究进展J中国实用中西医志,2009,25(8),930-9334 Peterson J J. 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