第五讲--基因定点诱变-PCR技术ppt课件

.,基因的定点诱变,概念：定点诱变：通过取代、插入或缺失克隆基因或DNA序列中的任何一个特定的碱基的技术。,.,M.Smith（加拿大生物化学家）1993年诺贝尔化学奖，1978年发明了寡核苷酸定点诱变技术。利用寡核苷酸定点诱变技术，可以认为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质之间的相互作用。,寡核苷酸定点诱变技术,.,基因诱变的应用,1结构和功能2基因的注释3代谢途径-分子育种4蛋白质的修饰5分子设计-分子进化工程,.,缺失诱变,1简单缺失通过对DNA片段中具有的相应的酶切位点进行切割，而后用T4连接酶进行连接。2系统缺失核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大片段,.,插入突变,1人工合成片段2Transposoninsertion（Tn5）3同源重组4PCR,.,基因的体外诱变,.,Kunkel法或称”U”法,dut-：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下有“T”占据的位置。ung-：UDG酶缺陷，UDG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）可除去DNA中的尿嘧啶,.,E.Coli（dut-，ung-）,合成的DNA中含有尿嘧啶，M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基。CJ236(dut-，ung-，F+),.,ssDNA制备载体,1单链噬菌体载体M132phagemid载体-辅助噬菌体,.,所用酶类,T4噬菌体聚合酶：诱变几率65%T7噬菌体聚合酶：3-5外切活性强，持续合成DNA的能力强，遇到引物时会停止。诱变几率83%KlenowDNA聚合酶：前端有引物或双链时，可能会替换。诱变几率36%,.,影响因素,1引物：热动力学（配对），突变碱基的左右8-10bp2T4连接酶35端磷酸化4单链结合蛋白：解决颈环结构,.,基因扩增（geneamplification）主要内容：1.体外扩增2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩增3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩增。4.程序基因扩增5.进化过程中的基因扩增,.,PCR技术在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。,.,.,.,ReactionConditionforaTypicalPCRAssay,.,TypicalPCRThermalProfile,*ThiscycleisnormallyincludedinaPCRassayinordertoallowany“unfinished”productfrompreviousamplificationtoachieveitsfulllength,.,SomeDNAPolymerasesUsedinPCR,.,CharacteristicsofTaqPolymerase,.,PCR引物：与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。1.其长度通常在1530个核苷酸之间。2.简并引物atggctant3.嵌套引物PCR扩增的长度：2kb,.,PCR技术的应用：1.基因组克隆突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的添加核算序列。,.,.,反相PCR(reversePCR)与染色体步移,.,不对称PCR(asymmertricPCR)用来制备单链的DNA特点：两种引物的浓度不同，低浓度的限制引物和高浓度引物，两者浓度相差约100倍。获得单链核苷酸的另一种方法是通过固相支持物作DA