




已阅读5页,还剩20页未读, 继续免费阅读
版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
.,基因的定点诱变,概念:定点诱变:通过取代、插入或缺失克隆基因或DNA序列中的任何一个特定的碱基的技术。,.,M.Smith(加拿大生物化学家)1993年诺贝尔化学奖,1978年发明了寡核苷酸定点诱变技术。利用寡核苷酸定点诱变技术,可以认为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质,从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质之间的相互作用。,寡核苷酸定点诱变技术,.,基因诱变的应用,1结构和功能2基因的注释3代谢途径-分子育种4蛋白质的修饰5分子设计-分子进化工程,.,缺失诱变,1简单缺失通过对DNA片段中具有的相应的酶切位点进行切割,而后用T4连接酶进行连接。2系统缺失核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大片段,.,插入突变,1人工合成片段2Transposoninsertion(Tn5)3同源重组4PCR,.,基因的体外诱变,.,Kunkel法或称”U”法,dut-:dUTP酶(dUTPase)缺陷,细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加,其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下有“T”占据的位置。ung-:UDG酶缺陷,UDG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)可除去DNA中的尿嘧啶,.,E.Coli(dut-,ung-),合成的DNA中含有尿嘧啶,M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基。CJ236(dut-,ung-,F+),.,ssDNA制备载体,1单链噬菌体载体M132phagemid载体-辅助噬菌体,.,所用酶类,T4噬菌体聚合酶:诱变几率65%T7噬菌体聚合酶:3-5外切活性强,持续合成DNA的能力强,遇到引物时会停止。诱变几率83%KlenowDNA聚合酶:前端有引物或双链时,可能会替换。诱变几率36%,.,影响因素,1引物:热动力学(配对),突变碱基的左右8-10bp2T4连接酶35端磷酸化4单链结合蛋白:解决颈环结构,.,基因扩增(geneamplification)主要内容:1.体外扩增2.通过体外重组和转化,将目的基因在宿主细胞进行扩增3.在环境作用下,生物体内相关基因的扩增。4.程序基因扩增5.进化过程中的基因扩增,.,PCR技术在1983年,美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,有称之为体外扩增法。,.,.,.,ReactionConditionforaTypicalPCRAssay,.,TypicalPCRThermalProfile,*ThiscycleisnormallyincludedinaPCRassayinordertoallowany“unfinished”productfrompreviousamplificationtoachieveitsfulllength,.,SomeDNAPolymerasesUsedinPCR,.,CharacteristicsofTaqPolymerase,.,PCR引物:与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。1.其长度通常在1530个核苷酸之间。2.简并引物atggctant3.嵌套引物PCR扩增的长度:2kb,.,PCR技术的应用:1.基因组克隆突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的添加核算序列。,.,.,反相PCR(reversePCR)与染色体步移,.,不对称PCR(asymmertricPCR)用来制备单链的DNA特点:两种引物的浓度不同,低浓度的限制引物和高浓度引物,两者浓度相差约100倍。获得单链核苷酸的另一种方法是通过固相支持物作DA
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 馆陶装配式别墅施工方案
- 卫生间淋浴门施工方案
- 团建活动帆船活动方案策划
- 古建筑区域搭建方案设计
- 教育引流策划活动策划方案
- 大型建筑护栏方案设计图片
- 酒店客房服务流程规范及标准
- 土方工程施工方案简易
- 平定联社营销方案
- 中学中考备考动员会总结报告
- 客运场站建设管理办法
- 2025年高中英语教师课程标准考试测试卷及答案(共三套)
- 工业园区管委会环保培训
- 【基于近几年数据的欧派家居盈利能力案例分析(数据图表论文)19000字】
- 正念冥想培训课件
- 学前儿童维生素卫生学纲要
- 供热维保管理制度
- DB3205-T 1073-2023 苏式传统文化 吴罗(提花罗)制作技艺传承指南
- 2025-2030中国实时动态(RTK)机行业市场发展趋势与前景展望战略研究报告
- 八年级物理上册(人教版2024)-新教材解读培训课件
- 施工现场实施信息化监控和数据处理施工现场实施信息化监控和数据处理及风险管理措施(工程技术标)
评论
0/150
提交评论