western-blot原理及操作流程ppt课件.ppt

1,WB实验技术及常见问题分析,2,Westernblot定义,WesternBlot中文一般称为蛋白质印迹通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上分离的蛋白可以通过一抗/二抗复合物进行检测是蛋白质分析的最流行的技术之一,3,WesternBlot操作流程,蛋白样品的制备（蛋白抽提、定量）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE凝胶制备、上样）,转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色,4,水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。细胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2g/mLAprotinin,0.5g/mLLeupeptin，pH8.0有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。,一、蛋白样品的制备,5,二、蛋白样品的定量(Bradford法),原理考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。制作标准曲线（插入表格）检测样品蛋白含量：取一管考马斯亮蓝+95l0.15mol/LNaClNaCl溶液+5l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入比色杯中测试。,6,20-30ug细胞/组织裂解物100ng纯化蛋白根据蛋白表达丰度调整适当的蛋白上样量上样量一致：每孔上样量保持一致上样前用loadingbuffer加热变性样本,三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,7,Anode-内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触,外槽中缓冲液带有正电荷，与凝胶底部接触,Cathode+带有负电荷的蛋白质从上到下运动（负极到正极），分开,电泳进程可以根据前沿指示剂来确定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止电泳,小分子量蛋白跑的比较快.蛋白根据分子量大小分开,蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动,标本加入到上样孔中,8,9,四、WesternBlot转膜,分离的蛋白通过电转膜方式从凝胶中转移到杂交膜上（PVDF或NC膜）,PVDF膜：价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。NC膜（硝酸纤维素膜）：价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。,10,五、封闭,脱脂奶粉（含5脱脂奶粉的TBST缓冲液）BSAWesternBlot膜封闭液（生物试剂公司提供）,11,六、一抗、二抗孵育,把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液与滤膜温育，室温小时或4过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。加入配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温一小时或4过夜。倒掉二抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。,12,七、二抗与底物反应显色,ECL化学发光显色比较常用，结果容易控制，但是被催化是灵敏度差一点DAB显色比较灵敏，是HRP最敏感的底物,13,WesternBlot需要的主要试剂,14,WB需要试剂膜,常用的有PVDF膜，硝酸纤维素膜或者尼龙膜,15,WB需要试剂封闭试剂,BSA或者脱脂奶粉(光明脱脂奶粉)商业化的封闭试剂,16,主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；使用预染的Marker还可以实时检测电泳分离情况，并可以转移到膜上。,WB需要试剂蛋白质Marker,Prestainedproteinladders,Unstainedproteinladders,Fermentas,17,WB需要试剂一抗,选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体根据说明书推荐的浓度优化最佳稀释比例,Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,Sigma,Abcam,R&D,Abnova,Chemicon,Calbiochem,Millipore,BD,Cayman,Roche,eBioscience,etal.,选择合适的一抗：,18,杂交需要试剂二抗,二抗选择：根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择合适的二抗。二抗的使用：根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时。,Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,Sigma,Abcam,R&D,Abnova,Chemicon,Calbiochem,Millipore,BD,Cayman,Roche,eBioscience,etal.,19,杂交需要试剂底物,显色底物：操作简单，灵敏度低，如TMB、DAB、BCIP/NBT化学发光底物：灵敏度高，需要曝光检测设备（暗室、曝光设备和胶片）或者凝胶成像设备。,20,WB常见问题,没有信号高背景非特异性条带条带大小不对,21,标本问题标本中不含检测蛋白：设置阳性对照上样量不够，或者蛋白表达丰度比较低：增加上样量转膜问题转膜不完全：转膜后使用丽春红染色，确定目的大小蛋白条带是否存在于膜上，使用蛋白质Marker.洗涤过度：减少洗涤时间和次数.封闭封闭过度：减少封闭试剂浓度，封闭时间，更换封闭试剂抗体孵育和检测抗体浓度和时间孵育不够：增加抗体浓度，延长孵育时间一抗不工作：设置阳性对照二抗不工作：和其他一抗配合检测二抗是否工作一抗/二抗不匹配：检查抗体的来源和亚型。正确选择二抗底物失活：重新配制有效的底物,没有信号/弱信号,22,背景高,封闭封闭时间不够：延长封闭时间优化封闭试剂的类型和浓度封闭试剂和抗体有交叉反应：更换封闭试剂.磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白的封闭试剂：推荐BSA封闭抗体孵育和检测一抗/二抗浓度太高：降低抗体浓度孵育温度太高：建议4度孵育过夜其他洗膜不充分：5*3mins，多次短时间的洗膜曝光时间过长：缩短曝光时间出现干膜现象：保证膜充分浸透，避免出现干膜二抗非特异性：设置只加二抗对照,23,非特异性条带,标本制备二聚体或者多聚体：增加上样前煮沸变性时间蛋白不同剪切体或者isoforms存在.蛋白降解：使用新鲜制备的标本，标本中加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂上样量过大：减少上样量封闭Blocking封闭不充分：优化封闭时间和封闭试剂浓度抗体孵育和检测一抗/二抗浓度过高：降低抗体浓度抗体没