DNA合成实验室的建立ppt课件.ppt

1,建立DNA合成平台所需要的仪器及试剂耗材一般要求DNA合成部分DNA合成后处理部分寡核苷酸纯化部分寡核苷酸检测部分,2,一，一般要求建立oligo寡核苷酸合成实验室一般原则如下。1，房间：一般情况下，需要5个房间或将房间分割为7个独立工作区域，房间要求通风状态良好。1.1合成间用于寡核苷酸的合成，包括合成柱装填及合成。1.2氨解间（区域）：用于合成产物的氨解及浓缩。1.3纯化间（区域）：合成产物的纯化，纯化方式为固相萃取，HPLC及电泳。电泳所需面积较大。1.4纯度检测间（区域）：用于测定合成产物的纯度。1.5定标及打印间：用于测定合成产物的OD值，分装，打印标签，贴标。1.6办公室1.7试剂准备间（区域）：如需自行配制试剂，可选择手套箱。2，人员：3-4人3，合成管理：推荐使用专业实验室管理软件，内容应包含试剂管理，客户管理，订单管理等内容。,3,二，DNA合成部分最好使用独立房间，请注意温度和湿度。1，仪器DNA合成仪，空调，除湿机，真空干燥箱（oven），UPS稳压电源，层流柜或通风橱，气瓶，计算机等。除DNA合成仪外，其它均可由用户自备。环境要求：干燥，实验室洁净，明亮，最好是净化实验室，但不可直晒。温度要求：室温。供气系统：高纯氩气或氮气（压力3个大气压）。,4,合成,5,合成,6,合成,7,合成,合成,8,试剂及耗材如需自行配制试剂，可单独划定区域放置手套箱，不宜离合成间太远。冷藏或冷冻保存的试剂须回复室温后使用。2.1DNA合成试剂：脱保护剂：deblockingreagent，3%TCA/DCM或3%TCA/DCE,用于合成过程中脱去碱基中的DMT保护基团。活化剂：activator，包括acitvator，activator42等，浓度一般选择0.25M，用户活化碱基单体。盖帽试剂A，CapA，盖帽试剂B，CapB：用于封闭未参加延长反应的CPG。氧化剂：使延长链形成稳定结构。氧化剂，溶解用乙腈（DNA合成级，水分含量10ppm），用于溶解单体。洗脱乙腈（水分含量30ppm）A,T,C,G单体：在低于10条件下保存，最好冷冻保存。CPG(controlledporeglass)载体：,9,手套箱,10,2.2DNA合成用耗材注射器：20ml一次性注射器，配长针头，用于溶解碱基时吸取溶解用乙腈，使用时可在真空干燥箱（oven）中40干燥后使用。滤片：用于封闭合成柱。合成柱：有些和程序需要购买合成柱，有些合成仪无需购买合成柱。活化分子筛，3A,用于碱基溶液及活化剂溶液防水，乙腈脱水。,11,三、DNA合成后处理部分最好使用独立房间。1，仪器真空泵，离心浓缩仪（带制冷），高速离心机，移液器，水浴锅。或选用专用裂解架。如合成产物为RNA，需配置冷冻干燥机。2，试剂耗材饱和氨水（32%），0.2ml薄壁管，1.5ml旋盖微量离心管。,12,四、寡核苷酸纯化部分合成的寡核苷酸常用的纯化方式脱盐、BioRP/OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。1，脱盐或OPC纯化固相萃取正压/负压固相萃取装置，真空泵，固相萃取小柱，注射器等加液方式可选用移液工作站，连续移液器。,13,OPC纯化，测OD值,14,2，HPLC纯化可选用任何品牌HPLC。蠕动泵须有连续梯度功能。进样池要求能达到1m,纯化柱可选用C18反向柱或阴离子交换柱。（1）仪器及配套HPLC,寡核苷酸纯化柱超声波清洗器。,15,（2）液相色谱纯化试剂：试剂选择原则：固体试剂为色谱纯，液体试剂为分析纯。主要试剂：冰醋酸(glacialaceticacid)，四乙胺（TEA），如需纯化G含量较高的寡核苷酸，需六氟异丙醇（HFIP），乙腈（HPLC级），纯净水主要耗材：量筒，移液器，枪头，抽滤装置及针筒式滤器，进样针，收集管等。,16,液相色谱,17,液相色谱,18,电泳,19,96通道毛细管电泳,五，寡核苷酸检测部分Oligo的检测分纯度检测及含量检测。纯度检测一般采用质谱或毛细管电泳方法，也