利用基因芯片进行基因表达谱分析

利用基因芯片进行基因表达谱分析,第三讲,RNA的检测:表达丰度，剪切体DNA的检测：SNP，CGH，MethylationcDNA芯片的主要用于：表达谱芯片，CGH寡核苷酸芯片主要用于：诊断芯片，SNP分型芯片,基因芯片应用,MoreMicroarrayApplications,ChromosomesDNAGenepromotersmRNAmRNAvariantsmicroRNAs,aCGH,SNPs,miRNA,DNA,RNA,SNPs,ChIP/LA,miRNA,GeneExpression,AlternateSplicing,双色荧光系统,cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核苷酸芯片实验组及对照组两种组织的mRNA在反转录成cDNA的过程中分别标记上Cy3和Cy5两种荧光，制备成探针，竞争性地与芯片上的核酸片段进行杂交两种波长的激光扫描读取竞争杂交的结果，通过计算机处理就能确定芯片上基因所结合探针的量，通过计算两种荧光强度的比值来判断两种组织中基因表达是否有变化。,数据分析、寻找差异表达的基因,Cy3标记的A组织mRNA,Cy5标记的B组织mRNA,混合探针,以两种波长的激光扫描Cy3-532nmCy5-635nm,杂交,双荧光系统芯片的原理及流程图,单色荧光系统,较短的寡核苷酸芯片如Affymatrix芯片；载有较长片段的寡核苷酸芯片也可使用，如Illumina芯片实验组和对照组分别用同样的荧光物质标记（或生物素biotin），分别与芯片杂交，即一张芯片只杂交一个样本根据杂交结果判断待测样品同芯片上哪个片段结合，通过与对照组的比较转化成基因表达的改变,数据分析、寻找差异表达的基因,探针A：biotin标记,扫描,杂交,探针B：biotin标记,两张芯片上相同位点信号比,单荧光系统芯片的原理及流程图,单通道和双通道的比较,单通道实验结果重复性更好，使得比较不同样品之间各种基因表达的相对比例是可靠的。进行多个样品之间（芯片之间）的比较时，只需在多个样本中设置对照。由于点样的是寡核苷酸，探针无法检测。双通道（点样cDNA）重复性相对较差，但是探针可以测序验证。双色法需在每次杂交检测中设置对照，只能进行两个样品之间的比较，芯片之间的比较并不可靠,ExpressionAnalysisArrays（Affymetrix),UniquePM-MMProbeDesign,11-20pairsof25merprobe,EachgeneisrepresentedontheprobearraybymultipleprobepairsEachprobepairconsistsofaperfectmatchandamismatcholigonucleotide,PerfectMatchMismatch,Chip,ProbePair,Probecellorfeature,PM-MM探针设计的优势,灵敏度的提高,将已克隆的转录产物以不同的浓度掺入到组织样品中。经过标记的样品与AffymetrixGenechip人类基因组芯片杂交，在克隆转录产物浓度低于8pM时，PM单独探针无法探测出相应的浓度变化，而与MM探针联合使用则可以探测出。,单链和双链探针,双链探针在液相条件下自我复性从而大大降低与固着的靶DNA杂交的机会，从而降低了探测灵敏度，因此需更多的探针量。单链，使杂交灵敏度提高,基因芯片实验流程及方法,cDNAmicroarray,TWOCHANNELMICROARRAY,AffymetrixExpressionAnalysis,ReverseTranscriptase,invitrotranscription,mRNA,cDNA,FragmentationofcRNA,cRNA,GeneChipHybridization,标记,实验过程,样本制备样本标记预杂交杂交洗涤染色（如生物素标记）扫描数据分析,HybridizationprocessofGeneChip,样本制备,表达谱基因芯片研究的对象是样本中的mRNA，抽提出的mRNA需要经过反转录酶的作用转变为cDNA，同时进行荧光标记，标记好的cDNA靶分子就可用于杂交。基因芯片实验中的RNA抽提大都采用分子生物学中传统的方法，但要求必须能够尽可能多的抽提出组织中的RNA分子，保持实验数据信息与组织中mRNA拷贝数信息之间的平行性。,mRNA的纯化方法,两步法：从样本中制备总RNA，再从总RNA中分离mRNA,总RNA中包括rRNA、tRNA和mRNA，其中以上是rRNA和tRNA，分离mRNA的原理一般利用真核生物的mRNA的端都有polyA尾，用poly（dT）-纤维素亲和层析纯化mRNA。一步法：从组织样本中直接用poly（dT）-纤维素亲和层析纯化mRNA，这种方法简便，但RNA的纯度不够，当组织量少或对RNA质量要求不高时可采用,逆转录：合成cDNA一链,mRNA逆转录合成cDNA时用poly（dT）作引物，可以直接用总RNA作为摸板进行逆转录标记，简化步骤，减少mRNA的损失，从而减少对组织的需求，也避免了从总RNA中纯化mRNA的工作总RNA的纯度不如mRNA高，直接从总RNA进行mRNA的逆转录在一定程度上会影响到逆转录标记的效率，需要尽可能保证总RNA的纯度,样本量,从多少总RNA中进行逆转录才能满足实验需要？非扩增：20微克；扩增：1微克有些情况下，样本极为稀有，不可能得到大量的mRNA靶分子基因芯片实验对总RNA量的需求在一定程度上限制了该技术的推广发展方向：提高检测灵敏度，减少基因芯片实验样本用量,核苷酸的修饰方法,荧光标记：需避光，合成效率低，不同的荧光修饰会影响标记效率，如Cy3标记的和Cy5标记的NTP掺入到DNA和RNA链中的效率是不一样的；最终也导致成本高荧光标记：标记分子在特定的波长范围被激光光源激发出荧光，从而对含有标记分子的样本进行检测。如花青素（Cyanin）Cy3、Cy5，其激发和发射波长分别为：550/570和649/670。大部分扫描仪都能对这两种荧光标记进行图像处理。这种标记方法没有同位素标记的限制；而且具有极高的灵敏度，能够进行定量检测,生物素标记的dNTP：利用biotin-StreptavidinphycoerythrinFluorescentdye的结合进行检测，标记探针稳定，不失活，并能配用多种检测系统，简单方便，扫描成本较低。荧光素标记的dNTP：Cy3-的dNTP，Cy5-的dNTP同位素标记的dNTPaminoallyl（氨烯丙基）NTP：便宜，掺入DNA和RNA链的效率与未标记的NTP相同；检测的时候只需在它的氨基反应基团上偶联Cy系列的染料或其他染料；但实验误差大,核苷酸的修饰方法,标记方法,RNA样本不扩增进行标记：在反转录的体系中加入Cy3或Cy5标记过的dNTP类似物，通过反转录酶的作用，标记新合成的cDNA。这种实验方法效率较低，对RNA样本需求量大，通常要50200g总RNA，13gmRNARNA样本扩增后进行标记,联合应用cDNA扩增和模板指导下的体外转录反应来完成线性扩增。PCR方法：同一用量和限制循环次数的条件下，通过RT-PCR可平行的扩增实验组和对照组的RNA样本以满足实验要求并同时进行荧光标记。,扩增mRNA（cRNA）靶分子,基于T7的mRNA线性扩增：利用模板指导下的体外转录反应来完成线性扩增。该方法能从150ngmRNA分子出发扩增出足够数量的cDNA靶分子。这种扩增方法更具线性,扩增mRNA（cRNA）靶分子,合成cDNA二链,在小鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶的作用下，反转录生产cDNA一链。MMLV反转录酶会在cDNA一链的3端加上非模板的寡聚C残基，这时加入3端带有寡聚G的引物，可以结合到cDNA的3端，生成一小段双链的cDNA，再在DNA聚合酶的作用下延伸形成加入RNaseH，水解掉RNA模板，以残留的与cDNA一链配对的短片段RNA为引物，在DNA聚合酶的作用下生成双链cDNA,mRNAcRNA,噬菌体T7DNA编码的酶，对T7启动子序列具有高度特异性，不能识别其它生物来源的启动子。是依赖于DNA的RNA聚合酶，具有53的RNA聚合酶活性，以含有T7启动子序列的双链DNA为模板，以NTP为底物，合成与启动子下游的模板DNA互补的RNA。,FragmentationofbiotinylatedcRNA,芯片杂交,将靶分子变性后，用预杂交液与芯片进行预杂交1小时左右（cDNA和长链寡核苷酸，42度（50甲酰胺）；短链寡核苷酸，50度）杂交：温度同预杂交，标记好的样品与杂交仓内反应14-18小时洗片，扫描检测杂交量依赖靶DNA和探针的浓度，当靶DNA浓度一定时，荧光信号强度在一定范围内与探针量成线性关系,RNA相对不稳定,杂交过程,影响杂交速率和杂交双链稳定性的因素1核酸浓度2探针的类型和长度3碱基组成4杂交液成分（1）离子强度（2）Formamide（3）季铵盐溶液（4）杂交加速剂5不匹配序列6杂交时间7杂交温度,原核生物样品,原始图象文件(Cy3/Cy5)定位栅格处理(griding)数据自动提取数据入表达谱数据库原始数据标准化(normalization)Ratio值分析Cluster分析显著性表达差异基因具有相似表达谱基因,数据分析流程图,Experimentgroup/control:Hepacellularcarcinoma/Normalliver,信号叠加图,Red:明显上调Yellow:差异不显著Green:明显下调,假阴性：一般不关心，但也要看实验目的假阳性：验证基因芯片结果需要传统方法的验证,新一代芯片技术光纤微珠芯片,ScreeningUnlabeledDNATargetswithRandomlyOrderedFiber-OpticGeneArrays,Steemers,F.J.,Ferguson,J.A.,Walt,D.R.,NatureBiotechnology,18,91-94,2000.Techview:MolecularBiology.Bead-BasedFiber-OpticArrays,Walt,D.R.,Science,287,451-452,2000DecodingRandomlyOrderedDNAArrays,KevinL.Gunderson,GenomeResearch,14:870-877,2004.,微珠,3.1um无孔无荧光硅珠每个微珠单独质控,光纤微珠芯片-技术原理,有效的反应表面积和体积比低/无背景大小均一,Oligator合成工厂,寡聚核苷酸探针,光纤微珠芯片-技术原理,96孔板全自动化合成LIMS控制所有过程年生产能力20million严格的QC系统OD260检测产量MALDI-TOF质谱检测UV毛细管电泳实时数码色彩监控,寡聚核苷酸探针,光纤微珠芯片-技术原理,73mer,探针与微珠连接,寡聚核苷酸探针,每个微珠上连接100万左右相同的探针,三步法微珠制备,RawBeadsSilanizationproducesageneralcouplingmoleculeanamineTrimethoxyaminopropylsilaneVerystablecomparedtoothertechniquesActivationPreparesthebeadtoattachtheOligoCyanuricChlorideImmobilizationofDNAComplexityDiscretereactions96Wellmicrotiterplate,每种(微珠+探针)单独合成并QC不同种微珠混合在一起形成微珠池(162424,000+种微珠),寡聚核苷酸探针,高杂交特异性全长序列探针定制灵活100%质量检控QC,BeadProduction,SynthesisofOligos,ActivatedBeadPlates,+,OligoPlates,Gilson96TipRobot,Oven,PooledBeadSet,QC,acidetch,strandcladding,strandcore,Photo-resist,Siliconwafer,plasmaetching,cleaning,Opticalfiber,3mbeadsinwells,芯片的组装,将微珠池内微珠倒入蚀刻光纤，微珠无序自组装进入小孔，每根光纤上带一个微珠每种微珠大约有30个重复,芯片的组装,消除系统随机误差高重复性微珠之间间距均一,光纤束-微珠,芯片的组装,传统芯片图,RandomBeadAssembly,MixtureofDifferentBeadTypes,6x2WholeGenomeBeadChip,BeadPoolispipettedontheSubstrate,NoInformationofBeadIdentityandlocationonArray,Decoderhybridization1,Decoderhybridization2,芯片解码,Gundersonetal.(2004)DecodingrandomlyorderedDNAarrays.GenomeResearch14,870-877.,4.芯片解码,指数级解码,XY=totalnumberofcodes,X=totalnumberofcolorsorstatesY=totalnumberofhybridizationstages,SingleIllumiCodeStrategy,Example:38=6,56148=65,536,每张芯片上每个微珠每个特性都被质控(100%QC)位置和强度控制有多少重复小部分不合格地被捡出是Illumina出厂前的生产步骤每个芯片在出厂前已通过解码和质控解码CD随芯片送至用户处,芯片解码,DecodingQualityMetrics,%ofBe