第二章：DNA与染色体ppt课件

.,第二章染色体与DNA,一、DNA的组成和结构（略）二、染色体的结构和组成三、DNA的复制四、DNA的修复五、DNA的转座,.,二、染色体的结构和组成,1、染色体概述染色体(chromosome)之所以称为染色体，是因为它能被碱性染料染色，而细胞的其他组成分都不能被碱性染料染色的缘故。细胞内的DNA主要在染色体上，所以染色体是遗传物质的主要载体。染色体由DNA和蛋白质两大部分组成。,.,人类的全部染色体,.,人类基因组各条染色体中碱基对数量和功能基因数量对照表（基因组是细胞内单套染色体及其上的基因),.,染色体存在于真核细胞内的核仁内，呈线性结构。细胞分裂时，每条染色体都复制生成一条与母链完全一样的子链，形成同源染色体对。染色体只有在细胞有丝分裂过程中才可见，而在分裂间期，则以松散的染色质形式存在于胞核中。原核细胞和真核细胞染色体在结构和组成上均有差别。原核细胞一般情况下只含一条染色体，基因序列与其编码的蛋白质序列基本呈线性对应。细菌DNA是一条相对分子质量在109左右共价闭合双链分子，通常也称为染色体。,.,.,2、真核细胞染色体的组成,2.1染色质和核小体染色质的电子显微镜图显示出由核小体组成的念珠状结构，可以看到由一条细丝连接着的一连串直径为10nm的球状体。核小体是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bpDNA组成的。,.,核小体单元的产生,.,双螺旋DNA经过一系列包装成为染色体的过程,30nm的染色体结构,.,2.2染色体中的核酸组成,同类生物不同种属之间DNA总量变化很大,横坐标为C值（value-paradox），指一种生物单倍体基因组DNA的总量。,2.2.1不同的生物DNA的量不同,.,编码每种生物所需DNA的最低值,生物越高等所需DNA的量越大,.,2.2.2真核细胞的DNA序列大致可分为3类,不重复序列中度重复序列高度重复序列卫星DNA,编码rRNA的基因上18S/5.8S/28S/间隔区组成的单位在DNA链上串联重复许多次（中度重复序列）,.,鼠染色体经原位杂交放射自显影后示卫星DNA的位置（黑色区域）,.,2.3染色体中的蛋白质,染色体上的蛋白质包括组蛋白和非组蛋白2.3.1组蛋白（histonesprotein）组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。通常可以用2mol/LNaCl或0.25mol/L的HCl/H2SO4处理使组蛋白与DNA分开。组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3及H4。,.,H1、H2A、H2B、H3及H4。这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精氨酸，其中H3、H4富含精氨酸，H1富含赖氨酸；H2A、H2B介于两者之间。,.,组蛋白的一般特性：,进化上的极端保守性在物种进化的历程中没有出现太大的变化。无组织特异性（组织特异性：特定的生物体组织中含有特定的某种组蛋白）肽链上氨基酸分布的不对称性（碱性氨基酸和酸性氨基酸在其肽链上不是均匀或对称分布）组蛋白的修饰作用被活性基团修饰。富含赖氨酸的组蛋白H5。,.,2.3.2非组蛋白（non-histoneprotein，NHP）是指染色体中组蛋白以外的其它蛋白质，它是一大类种类繁杂的各种蛋白质的总称。,非组蛋白的一般特性：非组蛋白的多样性。非组蛋白的量大约是组蛋白的60%70%，但它的种类却很多，约在20-100种之间，其中常见的有15-20种。非组蛋白的组织专一性和种属专一性。,.,几类常见的非组蛋白,HMG蛋白（highmobilitygroupprotein）。这是一类能用低盐（0.35mol/LNaCl）溶液抽提、能溶于2%的三氯乙酸、相对分子质量较低的非组蛋白，相对分子质量都在3.0104以下。DNA结合蛋白（与DNA结合紧密）。用2mol/LNaCl除去全部组蛋白和70%非组蛋白后，还有一部分蛋白必须用2mol/LNaCl和5mol/L尿素才能与DNA解离。这些蛋白分子量较低，约占非组蛋白的20%，染色质的8%。A24非组蛋白。,.,3、原核生物与真核生物染色体DNA比较,1.原核生物中一般只有一条染色体且大都带有单拷贝基因，只有很少数基因如rRNA基因是以多拷贝形式存在；2.整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成；3.几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。,.,4、原核生物基因组,从基因组的组织结构来看：结构简练存在转录单元有重叠基因,.,.,亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。,复制子（Replicon）；又称复制单位或复制元,DNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位1.3万90万不等,三、DNA的复制,.,复制体（Replisome）,复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同作用合成DNA,.,DNA复制在细胞周期的S期,.,3.1DNA的半保留复制（Semi-ConservationReplication）,1958Meselson-stahl设计的CsCl超离心试验证实了DNA复制的这一特性,概念：复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子代DNA分子,.,15N标记实验,细胞生长在15N标记培养基中转入正常N源培养基中分离各代DNA分析各代DNA的浮力密度,CsCL密度梯度离心浮力密度N15DNA1.742g/mlN15N14DNA1.717g/mlN14DNA1.710g/ml,.,3.2复制起点、方向和速度,复制起点（复制原点）复制开始处DNA分子的特定位置复制叉,原核生物（Prokaryote）：单复制起点即整个染色体只有一个复制单位（复制子）,.,.,领头链leadingstrand合成方向与复制叉解链方向相同，并可连续合成的子链。随从链laggingstrand合成方向与复制叉解链方向相反，并且是不连续合成的子链。冈崎片段okazakifragment在DNA复制过程中，随从链上初合成的不连续的DNA片段。半不连续性复制在DNA复制过程中，领头链连续复制而随从链不连续复制。,.,真核生物（Eukaryote）:多复制起点即一个genome中有多个复制单位,.,.,复制叉（Replicationfork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点,复制方向（复制过程的顺序性）,复制眼（replicationeye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛,.,真核生物的多复制子多个复制眼,.,.,单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉,单向复制,双向复制,.,复制速度,3H标记10min后复制的长度,取消标记后10min复制的长度,标记和取消标记后两个方向复制的长度相等,双向等速复制,.,3.3DNA复制的多模式,单起点、单方向（原核）,多起点、单方向（真核）,多起点、双方向（真核）,3.3.1线性DNA双链的复制,.,（1）Theta型复制双链环状DNA的复制眼可以形成一种结构，形状像希腊字母，因而叫型复制。,3.3.2环状DNA双链的复制,.,热链（标记链）,冷链（非标记链）,.,AreplicationeyeformsathetastructureincircularDNA.,.,(2)滚环型复制（rollingcirclereplication）,单向复制的特殊方式,大多数以对称方式进行即两条链同时复制。但也有一定时期内DNA只复制一条链的情况。,由于复制时产生的滚环结构形状象，又称复制病毒、细菌因子,.,（3）置换式（Displacementform）又称D环复制两条链的合成高度不对称,一条链迅速合成出互补链,另一条则形成游离的单链环(D-环)线粒体和叶绿体DNA的复制方式,.,3.4原核生物DNA复制的特点（大肠杆菌：双链环状）,四个9bp的重复序列dnaA结合位点,三个13bp的重复序列,DNA复制的起始区,.,.,（1）DNA双螺旋的解旋,在多种蛋白质及酶的参与下DNA双链解开，形成复制叉的复杂过程。重要的酶和蛋白质：,.,（2）DNA复制的引发,DNARNA引物新DNA链,先导链需一个引物RNA链，而滞后链需要若干引物RNA。,引发前体引发酶,共同作用,引发体,RNA引物,新DNA链,.,.,（3）DNA复制的终止,.,DNA聚合酶（DNApolymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶,以DNA为复制模板，将DNA由5端点开始复制到3端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。,DNA聚合酶,.,.,3.5真核生物DNA复制的特点,.,3.6DNA复制的调控,复制叉数量决定复制起始频率，复制起始频率受控于蛋白质和RNA。,.,.,.,四、DNA的修复（DNArepairing）,是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能。但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受DNA的损伤而可以继续生存。也许这些未能完全修复而留存下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这些修复功能，就无法对付经常发生的DNA损伤事件，细胞就不能生存。,.,DNA分子的自发性损伤,1、DNA复制中的错误以DNA为模板按硷基配对进行DNA复制是一个严格而精确的事件，但也不是完全不发生错误的。2、DNA的自发性化学变化生物体内DNA分子可以由于各种原因发生变化，至少有：碱基的异构互变；碱基的脱氨基作用；脱嘌呤与脱嘧啶；碱基修饰与链断裂,.,物理因素引起的DNA损伤,1、紫外线引起的DNA损伤当DNA受到最易被其吸收波长（260nm）的紫外线照射时，主要是使同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体。2、电离辐射引起的DNA损伤电离辐射损伤DNA有直接和间接的效应，直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭损伤；间接效应是指DNA周围其他分子（主要是水分子）吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA。损伤包括：碱基变化;脱氧核糖变化;DNA链断裂;交联。,.,化学因素引起的DNA损伤,1、烷化剂对DNA的损伤碱基烷基化;碱基脱落;断链;交联2、碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤如:人工可以合成一些碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。还有一些人工合成或环境中存在的化学物质能专一修饰DNA链上的碱基或通过影响DNA复制而改变碱基序列，例如亚硝酸盐能使C脱氨变成U，经过复制就可使DNA上的G-C变成A-T对。,.,.,DNA损伤的修复机制:,（一）错配修复,（mismatchrepair）：在含有错配碱基的DNA分子中，使正常核苷酸序列恢复的修复方式。修复的过程是：识别出正确的链，切除掉不正确的部分，然后通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用，合成正确配对的双链DNA。,.,1、参与错配修复的酶与蛋白质Dam甲基化酶:使5-GATC序列中的腺苷酸甲基化，使发生错配时修复。MutH、MutL、MutS蛋白：DNA错配修复蛋白解螺旋酶;DNA聚合酶;外切酶、；RecJ核酸酶：作用于单链DNA，沿53方向催化去除单磷酸脱氧核苷酸。DNA连接酶（Pol）；DNA复制所需的一种聚合酶。SSB：一种单链结合蛋白，可以牢牢地结合在单链DNA上，这不但可避免拆开的DNA双链再合拢，也可保护复制中的DNA单链部分不被核酸酶降解。,.,MutS识别并结合于碱基错配处,MutH-MutL二聚体结合后沿两个方向移动，形成DNA环，直至遭遇半甲基化的CTAG。,MutH在CTAG的5-端切开一个切口，核酸外切酶、沿35方向切除含配错碱基的新链,DNA聚合酶补缺，DNA连接酶连接切口。,高度耗能的错配修复,错配,.,.,(二)碱基的切除修复（base-excisionrepair）,修复由于碱基变化引起的受损核苷酸。,a、碱基脱氨反应b、核苷酸脱嘌呤反应,.,(二)碱基的切除修复（base-excisionrepair）,（a）DNA糖基化酶切除损伤的碱基产生无碱基酸,（b）无碱基核酸内切酶无碱基酸处切开产生切口。,（c）DNA聚合酶将无碱基酸切除并填补缺口。,（d）DNA连接酶连接切口。,AP位点,.,（三）核苷酸的切除修复,DNA解螺旋酶,.,（五）重组修复,又叫复制后修复：发生在复制之后。复制时，跳过损伤部位，新链产生缺口由母链弥补，然后用新合成的序列补上母链空缺。原损伤部位并没有切除,但在后代逐渐稀释。,.,（六）DNA的直接修复,.,.,1、形成嘧啶二聚体,2、光复合酶结合于损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,DNA紫外线损伤的光复合酶修复,.,.,（七）SOS反应和诱导修复（易错修复）,SOS反应：细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急状态下，为求生存而出现的应急反应。,SOS反应包括:,避免差错的修复能力增强,诱导产生无校正功能的DNA聚合酶合成,抑制细胞分裂,SOS反应是生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。对原核生物它产生高变异，对高等动物则是致癌的。,.,五、DNA重组与转座,5.1DNA重组5.1.1概念：是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。5.1.2意义：重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有生物的进化；没有重组也就没有现代的分子克隆技术。,.,5.2DNA重组的类型5.2.1同源重组（HomologousRecombination）5.2.2位点特异性重组（Site-specificRecombination）,.,一、概述1、定义：两个DNA分子同源序列（指从某一共同祖先经过趋异进化而形成的不同序列。）之间进行的重组2、条件：（1）两个DNA分子有同源序列（相关的酶可以用任何一对同源序列为底物）（2）两个DNA分子必须紧密接触3、发生：真核生物:非姐妹染色单体交换相对应的区域。原核生物:依赖RecA蛋白（重组蛋白类），并形成Holliday结构。（见下图）,5.2.1同源重组（HomologousRecombination）,.,.,二、大肠杆菌同源重组的分子基础（一）RecA1、作用：可促进单链同化或单链吸收RecA具有使DNA单链置换双链中同源链的能力2、单链同化发生的三个条件（1）其中一个DNA必须存在单链区（2）其中一个DNA必须有一个自由3末端（3）此单链区和3末端必须位于两分子之间互补的区域内（二）RecBCD复合体1、酶的活性：（1）核酸酶（2）解旋酶（3）ATPase2、作用：在Chi位点（RecBCD的靶序列）处产生含3游离未端单链.（见下图）,.,.,（三）Chi位点RecBCD识别的靶位点5GCTGGTGG33CGACCACC5是重组频率较高的部位E.coli中每隔约510kb有一个拷贝,.,Holliday结构的形成：1.同源序列排列在一起；2.酶切。通过核酸酶和RecBCD蛋白复合体的作用在一对同源DNA上产生切口；3.入侵。含有3端切口的ssDNA（singlestrandDNA）被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA细丝；RecA-ssDNA细丝寻找相对的DNA双螺旋上的相应序列。4.游离端交叉连接，形成Holliday结构5.通过分支迁移产生异源双链DNA。6.空间重排。十字型两臂旋转180度7.解离(两种不同方式)8.修补连接,.,基因敲除技术(Geneknockouttechnology)同源重组的应用是80年代后期，应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体上观察实验动物，推测相应基因的功能。,.,5.2.2位点特异性重组（Site-specificRecombination）,不依赖于DNA顺序的同源性，而依赖于能与某些酶相结合的特异的DNA序列的存在。,整合的过程（1）具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与attP和attB位点结合。（2）Int的拓扑异构酶活性，使两条双链各自断开一条单链，瞬间旋转然后交换连接。（3）同时在另两条单链之间发生同样的断裂重接，从而完成双链间的重组。,.,5.3DNA的转座（Transposition）,基因组是相对稳定的，基因组中的序列通常处于恒定的位置。因此，我们可以通过构建遗传图谱(geneticmap)来鉴定已知基因的基因座（基因在染色体上所占的位置）。在分子水平上，每个个体基因组之间的差异主要由重组引起，但转座元件（transposableelement）或转座子（transposons）的存在也可以造成基因组的改变。,染色体上的基因座，上方是p臂，下方是q臂。,.,5.3.1DNA转座的概念,DNA的转座又叫移位，是指DNA从染色体的一个位置跳到另一个位置，甚至从一条染色体跳到另一条染色体。是由可移位因子介导的遗传物质的重排现象。,.,5.3.2转座子的概念及发现,转座子(transposon或transposableelement，Tn)是基因组内相对独立的、可移动序列，它们不必借用噬菌体或质粒的形式就可以从基因组的一个部位直接转移到另一个部位，这个过程称为转座.（transposition）。转座子每次移动时携带着转座必需的基因一起在基因组内跃迁，所以转座子又称跳跃基因（jumpinggene）。,.,转座子是基因组的正常组成成分，不以独立的形式存在（如噬菌体或质粒DNA）。转座的发生不依赖于转座子和靶位点之间任何的序列同源性，在基因组内由一个部位直接转移到另一个部位。转座以很低的频率发生，而且转座子的插入是随机的。转座子有时插入到一个结构基因或基因调节序列内，引起基因表达的改变。,.,转座子也可以引起基因组序列的重排，它们的移动也和进化有关转座元件首先是由BarbaraMcClintock于40年代在玉米的遗传学研究中发现的，她称之为控制元件（controllingelement），因为它不仅能够在基因组内转移，而且还能够改变基因的活性并引起功能的改变。现在认为转座子存在于地球上所有的生物。,.,.,5.3.3转座子的分类和结构特征,最简单的转座子被称为插入序列IS（insertionsequences,IS）。不含有任何宿主基因，IS元件是细菌染色体和质粒的正常组成部分。最早被鉴定的转座元件是细菌操纵子中的自主插入序列。这种插入阻止了插入部位基因的转录和/或翻译。,5.3.3.1插入序列（insertionalsequence，IS）,.,IS元件是独立的结构单位，每个元件只编码为自身转座所需要的蛋白质。IS元件的末端为短的反向末端重复序列（invertedterminalrepeats），通常这两个拷贝密切相关，但并不完全一样。,.,在插入部位，ISDNA总是和很