第六章 电化学分离法

.,第六章电化学分离法Electrochemicalseparation,第一节电泳分离法第二节化学修饰电极分离法,.,61电泳分离法,一、电泳分离法的原理二、电泳分离法的分类三、高效毛细管电泳四、电泳分离法的应用,.,一、电泳分离法的原理,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。,.,一、电泳分离法的原理,1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；,.,.,一、电泳分离法的原理,当带电离子以速度在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。,电场力：FE=qE阻力：F=f故：qE=fq离子所带的有效电荷；E电场强度；离子在电场中的迁移速度；f平动摩擦系数(对于球形离子：f=6r；r离子的表观液态动力学半径；介质的粘度；),.,一、电泳分离法的原理,所以，迁移速度：,（球形离子）,物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。淌度（迁移率）：单位电场强度下的平均电泳速度。,（61）,.,一、电泳分离法的原理,另外，根据离子迁移率的定义，也可以写成：,式中，V是外加电压，L是两电极间的距离，t是电泳的时间，s是带电质点在时间t内迁移的距离。,根据上式，两种粒子迁移距离之差为：,（63）,（62）,.,一、电泳分离法的原理,影响带电粒子分离程度的因素1）带电粒子迁移率（淌度）根据（63）式，两种粒子的淌度差越大，分离越好。而根据（61）式可知：带电粒子的淌度与电荷成正比，与离子半径成反比。所以，电荷与半径相差越大，越容易用电泳法分离。,.,一、电泳分离法的原理,2）电解质溶液的组成据（61）式，溶液组成不同，粘度不同，导致迁移率不同。另外，电解质组成不同，有时会改变测定物的电荷及半径，从而导致迁移率不同。,.,一、电泳分离法的原理,3）外加电位梯度电位梯度是指每厘米的平均电位降，即V/L，当L一定时，加在两电极间的电压越高，分离所需的时间越短，分离越完全。对于分离性质相近的元素，多半使用高压电泳，其电位梯度达100V/cm以上,但高电场会产生焦耳热，使柱效降低。,.,一、电泳分离法的原理,4）电泳时间电泳时间越长，离子分离越完全。但分离性质相似的元素，单靠增加电泳时间收效不大。,.,二、电泳分离法的分类,电泳分为前流型和区带型。前流型是指无支持体的溶液自由进行的，而区带型是指在一个支持体上进行的电泳。后者应用最广。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳（即前流型）、毛细管等；,传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。,.,三、高效毛细管电泳,1.高效毛细管电泳的发展与特点2.高效毛细管电泳的基本理论3.高效毛细管电泳的仪器4.高效毛细管电泳的分离模式,.,1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达4105/m理论塔板数，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳。,1.高效毛细管电泳的发展与特点,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了20-75m内径的毛细管；二是采用了高达数千伏的电压。,.,1.高效毛细管电泳的特点,1）仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶2）分析速度快、分离效率高在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105107/m理论塔板数；,.,1.高效毛细管电泳的特点,3）操作方便、消耗少进样量极少，水介质中进行；4）应用范围极广有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；,.,2.高效毛细管电泳的基本理论,1）电渗流现象当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。,.,2.高效毛细管电泳的基本理论,当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。,.,2.高效毛细管电泳的基本理论,石英毛细管，柱内充液pH3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。,在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。,.,2.高效毛细管电泳的基本理论,电渗流的大小用电渗流速度电渗流表示，取决于电渗淌度和电场强度E。即电渗流=E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即=0/0真空介电常数；介电常数；毛细管壁的Zeta电势。电渗流=0E/,2）HPCE中电渗流的大小,.,2.高效毛细管电泳的基本理论,实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算电渗流=Lef/teoLef毛细管有效长度；teo电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。,.,2.高效毛细管电泳的基本理论,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；,3）HPCE中电渗流的方向,.,2.高效毛细管电泳的基本理论,改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。,.,2.高效毛细管电泳的基本理论,4）HPCE中电渗流的流形,电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。,.,2.高效毛细管电泳的基本理论,5）HPCE中电渗流的作用,电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流+ef阳离子运动方向与电渗流一致；-=电渗流-ef阴离子运动方向与电渗流相反；0=电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。,.,.,.,电渗在电泳分离中扮演着重要角色，是伴随电泳产生的一种电动现象。多数情况下，电渗流速度是电泳速度的5-7倍。因此，在HPCE中利用电渗流可将正、负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移，在一次HPCE操作中同时完成正、负离子的分离测定。由于电渗流的大小和方向可以影响HPCE分离的效率、选择性和分离度，所以成为优化分离条件的重要参数。电渗流的细小变化将严重影响HPCE分离的重现性（迁移时间和峰面积）。所以，电渗流的控制是HPCE中的一项重要任务。,.,2.高效毛细管电泳的基本理论,6）HPCE中影响电渗流的因素,i）电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。,ii）毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；,.,2.高效毛细管电泳的基本理论,iii）溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；,.,4.高效毛细管电泳的分离模式,）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；）可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；,）色谱与电泳分离模式的结合。,.,4.高效毛细管电泳的分离模式,4）毛细管等电聚焦（CIEF）,）根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；）毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；）氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；,.,4.高效毛细管电泳的分离模式,4）毛细管等电聚焦（CIEF）,）聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；,）阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；）加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；）电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。,.,4.高效毛细管电泳的分离模式,）将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。）负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。,5）毛细管等速电泳（CITP）,.,4.高效毛细管电泳的分离模式,）不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E)，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队；）特点：界面明显，富集、浓缩作用；,.,四、电泳分离法的应用,1.离子分析analysisofion2.药物分析analysisofpharmaceutics3.手性化合物分析analysisofchiralcompounds4.氨基酸分析analysisofaminoacids5.核酸分析及DNA测序analysisofnucleicacidsandsequenceofDNA6.新进展及热点问题advancesandspecialtopics,.,1.离子的分析,阳离子分析迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；,.,1.离子的分析,阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；质量小、电荷密度大的离子如：SO4-2、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；离子价态及存在形态分析；,.,2.药物分析,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；,采用MEKC（胶束电动毛细管色谱）模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLC法,.,合成获得单一手性化合物相当困难；528种手性合成药物，61中以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；R-反应停是安眠药，S-式致胎儿畸形；HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）,3.手性化合物分析,.,4.氨基酸和蛋白质分析,采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸；HPCE可取代传统的氨基酸分析仪；,蛋白质分析,.,5.核酸分析和DNA排序,重要分析手段；图，酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；,.,1）微型化整体化学分析系统（TAS）及TAS微型化在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数105/m；2）联用仪器CE-MS；3）阵列毛细管凝胶电泳应用于人类基因DNA测序；510万个基因，30亿个碱基对，目前最有效的DNA序列分析仪，10小时/次；可同时电泳24个样品；速度1200碱基对/小时，提高速度！100支毛细管阵列电泳；速度280碱基对/小时/支,6.新进展,.,62化学修饰电极分离法,一、概述二、化学修饰电极的分类三、化学修饰电极的电极处理和表征四、化学修饰电极分离法的应用,.,一、概述,1973年，Lane和Hubbard开辟了改变电极表面结构以控制电化学反应过程的新概念，指示了化学修饰电极的萌芽。1975年，Miller和Murray分别报道了电极表面进行化学修饰的研究，标志着化学修饰电极正式问世。,.,一、概述,通过共价键合、吸附、聚合等手段有目的的将具有功能性（如催化、配合、电色、光电）的物质引入电极表面，使电极赋予新的、特定功能的过程称为电极的化学修饰，所得到的电极称为化学修饰电极。广义上的修饰电极也包括通过物理方法制备的修饰电极。,【化学修饰电极】,.,二、化学修饰电极的分类,1.吸附型：通过吸附的方式将修饰物质结合在电极表面的方式，可以制备单分子层和多分子层。平衡吸附型：修饰物质在电极表面形成热力学吸附平衡。方法简单、直接，但修饰物质有限，应用较少。静电吸附型：离子通过静电引力在电极表面集聚，形成多分子层。LB膜型：不溶于水的表面活性物质在水面上形成排列有序的单分子膜(Langmuir-Blodgett，LB膜)。SA膜：通过分子的自组装作用在固体电极表面形成有序的单分子膜（selfassembling，SA膜）。涂层型：将功能性物质涂布在电极表面形成的薄膜。,.,二、化学修饰电极的分类,吸附修饰电极的制备,单层吸附膜复合膜,化学吸附法：是利用固体/溶液界面间的自然吸附现象来制备单分子层修饰电极的简便方法，具有简单，直接的优点。,.,二、化学修饰电极的分类,LB膜：不溶于水的表面活性物质在水面上形成排列有序的单分子膜，(LB膜)。SA膜：基于分子的自组作用，在固体表面形成高度有序的单分子膜，自组装膜（selfassembl-ing,SA膜）。,SA膜法能获得可控制的和均一的粗糙度的表面，表面具有很好的耐久力和稳定性，比LB膜法更加简单易行。,优点,.,纳米金自组装电极的制备方法,裸金电极预处理cysteine冲洗浸泡纳米金4C下保存,.,二、化学修饰电极的分类,2、共价键合型：在电极的表面通过键合反应把预定功能团接在电极表面。常用基体电极有碳电极、金属和金属氧化物电极,.,二、化学修饰电极的分类,3、聚合物型：利用聚合反应在电极表面形成修饰膜的电极。制备方式有氧化还原沉积、有机硅烷缩合、等离子聚合、电化学聚合等。,4、其他类型：无机物修饰电极，如普鲁士蓝修饰电极；粘土修饰电极；沸石修饰电极；金属及金属氧化物修饰电极。,.,三、化学修饰电极的电极处理和表征,1.电极的预处理,由于在固体电极上电化学行为的重现性差，在修饰前必须对电极表面进行清洁处理。,固体电极重现性差的主要原因：固体表面状态差异金属和碳材料的表面具有一定的表面能，这种表面能的分布不均匀。晶面上存在的缺陷，如台阶、纽结、位错和吸附原子等，使溶液中的许多物质很容易吸附到这些具有高能的位点上而造成污染。同时金属和碳的表面都能被化学的或电化学的方法氧化，氧化作用的同时也增加了表面粗糙度，容易形成惰化层。,.,三、化学修饰电极的电极处理和表征,2.清洁电极表面的方法：1）机械研磨，抛光至镜面。当电极表面存在惰化层和很强的吸附层时必须用机械或加热的办法处理。抛光电极的材料：金刚砂，CeO2，ZrO2，MgO，Al2O3粉等。抛光时按粒径降低的顺序进行研磨。抛光后移入超声水浴中清洗，直至干净。,.,三、化学修饰电极的电极处理和表征,2)化学法和电化学法处理化学的和电化学的处理，是最常用来清洁，活化电极表面的手段。电化学法常用强的矿物酸或中性电解质溶液，有时也用配位作用弱的缓冲溶液在恒电位，恒电流或循环电位扫描下极化，可获得氧化的、还原的或干净的电极表面。,2.清洁电极表面的方法：,.,三、化学修饰电极的电极处理和表征,鉴定电极表面是否清洁的方法对于碳电极，采用观测Fe(CN)63-在中性电解质水溶液中的伏安曲线的方法。在1103mol/L的K3Fe(CN)6磷酸盐缓冲溶液中扫描，直到出现可逆的阴极和阳极峰。对于铂电极，在稀硫酸中进行循环电位扫描，观察氢和氧的电化学行为，即出现了氢和氧的各自的吸附和氧化峰就表示表面已清洁。,金电极表面清洁的鉴定,对于金电极，在稀硫酸中进行循环电位扫描，观察其氧化与还原峰电位。直到其氧化和还原峰完全重合，即表示电极表面已清洁。,.,三、化学修饰电极的电极处理和表征,3.化学修饰电极的表征：,电化学法:循环伏安法、计时电流法、计时电位法、计时库仑法、脉冲伏安法、交流阻抗法光谱电化学法：红外光谱、拉曼光谱、荧光光谱、偏振光谱、紫外可见光谱、圆二色谱波谱法能谱法显微学法：扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）、扫描隧道显微镜（STM）、扫描电化学显微镜（SECM）石英晶体微天平法,SEM:利用二次电子信号成像来观察样品的表观形态。(利用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生的各种效应来进行表观分析),裸金电极和纳米金自组装金电极的SEM照片,裸金电极,16nm金修饰金电极,.,STM：头部为单个原子的极细的针尖去接近样品表面，当针尖与样品表面很近（1nm）时，针尖头部的原子与样品表面原子的电子云发生重叠，此时若在针尖和样品之间加一个偏压，电子便会穿过针尖和样品之间的势垒而形成纳安级的隧道电流。AFM：通过检测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构与性质。,纳米金自组装金电极的AFM,电子自旋共振（ESR）是专门用于研究含有未成对电子物质的波谱技术。把它应用于修饰电极可以推断形成的自由基结构。表面分析能谱法用于研究修饰表面的微观结构、组成和状态。常用的能谱有X射线光电子能谱(XPS)，俄歇电子能谱(AES)，二次离子质谱等。,.,石英晶体微天平是一种具有10-9g数量级测量质量变化能力的特别灵敏的检测器。可用于测量固体电极表面层中质量、电流和电量随电位的变化关系。从而认识电化学的界面过程，膜内物质传输，膜生长动力学和膜内的化学反应等。,石英晶体微天平（QuartzCrystalMicrobalanceQCM）的发展始于上世纪60年代初期，它是一种非常灵敏的质量检测仪器，其测量精度可达纳克级，比灵敏度在微克级的电子微天平高100倍，理论上可以测到的质量变化相当于单分子层或原子层的几分之一。石英晶体微天平利用了石英晶体谐振器的压电特性，将石英晶振电极表面质量变化转化为石英晶体振荡电路输出电信号的频率变化，进而通过计算机等其他辅助设备获得高精度的数据,.,四、化学修饰电极分离法的应用,可利用电催化反应以提高测定的选择性和灵敏性。如聚乙烯二茂铁修饰膜可催化氧化抗坏血酸。可利用离子交换反应进行选择性富集。如用Nafion/GC电极可选择交换多巴胺等，而抗坏血酸和尿酸不干扰测定。,多巴胺由脑内分泌，可影响一个人的情绪。ArvidCarlsson确定多巴胺为脑内信息传递者的角色使他赢得了2000年诺贝尔医学奖。多巴胺是一种神经传导物质，用来帮助细胞传送脉冲的化学物质。这种脑内分泌主要负责大脑的情欲，感觉，将兴奋及开心的信息传递，也与上瘾有关。,.,四、化学修饰电极分离法的应用,可利用表面配合反应进行富集分离，在电极表面修饰上配合剂和鳌合剂，使待测离子与之发生配合反应而被选择分离。,.,四、化学修饰电极分离法的应用,1、电化学传感器一般是利用修饰膜的选择透过性修饰电极的离子筛效应以及催化特性（如修饰酶的催化作用）。现已广泛应用于pH传感器、电位传感器、电流传感器、离子敏感电子器件、生物物质和药物等的传感电极中。其中pH传感器研究最多，一些含羟基、N原子的芳香化合物聚合到电极表面后都具有pH响应功能，尤以苯胺及衍生物为最。,.,四、化学修饰电极分离法的应用,2、在伏安分析、电位溶出中的应用当修饰剂选择具有配合富集能力的有机物或聚合物时，修饰电极便可用于溶出伏安法或电位溶出法中的工作电极，可大大提高富集能力。电极表面的活性基团与溶液中的待测物有四种相互作用：1）离子交换作用；2）络合作用；3）离子交换-络合协同作用；4）选择性吸附。可使被测物选择性分离、富集，大大提高了分析的灵敏度。除无机物外，一些电活性有机物也可以富集测定，如左旋多巴、甲氨喋呤、多巴胺、抗坏血酸等。,.,四、化学修饰电极分离法的应用,3、电催化许多物质在空白电极上反应迟钝、过电位大、可逆性差，用一般电极难检测。利用化学修饰电极的电催化特性，不仅降低了被测物的超电位，加快了反应速率，还增加灵敏度。利用这种特性非常适用于流动注射（FIA）和液相色谱（HPLC）的电化学检测。如用聚苯胺修饰铂电极作为HPLC的电流检测器，对维生素C进行检测，不仅稳定可靠，而且排除了复杂基体的干扰。,.,四、化学修饰电极分离法的应用,4、在