代谢控制发酵的基本思想

.,1,第三章代谢控制发酵的基本思想,第二讲,.,2,基本思想：,一切断支路代谢二解除菌体自身的反馈调节三去除终产物四增加前体物的合成五特殊调节机制的利用六条件突变株的应用七选育不生成副产物的菌株八选育生产代谢拮抗物质的菌株,.,3,四.增加前体物的合成,通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株以及克隆某些关键酶的方法，增加目的产物的前体物的合成，有利于目的产物的大量积累。,.,4,(1)在分支合成途径中，切断目的产物外的其他控制共用酶的终产物分支合成途径，增多目的产物的前体，使目的产物的产量提高。,.,5,例1,预苯酸,苯丙酮酸,L-苯丙氨酸,前酪氨酸,L-酪氨酸,预苯酸脱氢酶PD,预苯酸脱水酶PT,PD缺陷型,.,6,例2：,在赖氨酸的发酵育种上，对育出的解除了赖氨酸反馈调节的突变株，通过增加丙氨酸营养缺陷等遗传标记，提高产量。,.,7,葡萄糖,丙酮酸,丙氨酸,天冬氨酸,天冬氨酸半醛,苏氨酸,二氢吡啶二羧酸,赖氨酸,亮氨酸,协同反馈抑制,L-氨基酸,-酮酸,A,B,乳糖发酵短杆菌中赖氨酸,丙氨酸的生物合成途径及其调节,A：L-氨基酸丙酮酸转氨酶B：天冬氨酸-脱羧酶,反馈阻遏,反馈抑制,抗S-（2-氨乙基）-L-半胱氨酸,丙氨酸缺陷型,.,8,（2）目的产物的生物合成从别的终产物（氨基酸等）开始时（即别的终产物是目的产物生物合成的前体），除设法解除目的产物自身合成的反馈调节外，也应该设法解除其前体物合成的调节。,.,9,举例：,选育异亮氨酸菌株时，苏氨酸是异亮氨酸的前体物。为了积累异亮氨酸，除设法解除异亮氨酸自身合成的反馈调节外，还需设法解除苏氨酸的反馈调节，增加异亮氨酸的产量。,.,10,葡萄糖,天冬氨酸,天冬氨酸半醛,高丝氨酸,苏氨酸,-酮丁酸,异亮氨酸,赖氨酸,蛋氨酸,高丝氨酸脱氢酶,抗苏氨酸结构类似物2-氨基-3-羟基戊酸（AHVr）突变株,.,11,（3）在生物合成途径中,分支点的分解途径的代谢流增强，使分支点处的中间产物增多，导致目的产物的积累增加。,.,12,葡萄糖,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰CoA,乙酸,乙酰磷酸,柠檬酸,顺乌头酸,异柠檬酸,草酰乙酸,苹果酸,反丁烯二酸,琥珀酸,a-酮戊二酸,乙醛酸,乙酰CoA,L-谷氨酸,黄色短杆菌由葡萄糖和乙酸合成谷氨酸的代谢途径,磷酸转乙酰酶,磷酸转乙酰酶,.,13,（4）利用基因工程技术，将生物合成途径中的关键酶基因克隆到多拷贝质粒上，使其大量扩增，从而也就增加了目的产物的前体物的合成。近年来已见报道的有苏氨酸、色氨酸、脯氨酸、缬氨酸、酪氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和谷胱甘肽等氨基酸育种应用重组DNA技术提高产量。,.,14,有报道将具有结构类似物抗性的E.coliK12菌株中Thr操纵子与pBR322质粒相结合，获得重组质粒再转移给适当的受体菌，由于基因扩增，此基因工程菌可产苏氨酸达55g/L，比原株提高34倍。,.,15,一个细胞在代谢调节中产生阻遏物的量仅满足于和操纵基因结合，如果细胞中含有很多的操纵基因和结构基因，那么一个调节基因所产生的阻遏物就不足以阻遏全部操纵子的活力，因而逃避了调节基因产生的阻遏作用，称为“逃避合成”，这是最直接的提高目的产物产量的方法之一。,.,16,例如，-半乳糖苷酶、青霉素酶、氯霉素转酰酶和天冬氨酸转氨甲酰酶，可借助含有相应结构基因的质粒转移给受体培养物来增加产量；利用含有对苯丙氨酸合成酶编码的结构基因的转导噬菌体可使该酶产量增加15倍。,.,17,小结：增加前体物合成的途径：,切断分支代谢途径解除前体物的反馈调节增强分支点代谢流增加关键酶的表达,.,18,五、特殊调节机制的利用,1.多种产物控制机制的利用2.平衡合成的利用3.代谢互锁的利用4.优先合成的变换,.,19,1.多种产物控制机制的利用,在多种产物控制机制中，只有当反馈控制有关的全部终产物同时过剩存在时，才产生完全的或最大的反馈控制。任一种终产物过量时，完全不产生或产生部分的反馈控制。利用这种特性，可设法控制目的产物以外的终产物供给量，使目的产物积累。,.,20,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,天冬氨酰半醛,二氢吡啶二羧酸,赖氨酸,高丝氨酸,O-乙酰高丝氨酸,蛋氨酸,O-磷酸高丝氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,天冬氨酸激酶,高丝氨酸脱氢酶,高丝氨酸激酶,黄色短杆菌赖氨酸的合成调节,TD,HT,反馈控制,高丝氨酸脱氢酶缺陷,高丝氨酸激酶缺陷,.,21,2.平衡合成的利用,A,B,C,D,E,F,G,a,b,底物A经分支合成途径生成E和G，由于a酶的活性大于b酶，结果优先合成E。E过量后就抑制a酶，使代谢转向G。G过量后就会拮抗或逆转E的反馈抑制作用，结果使代谢流转向合成E，如此循环不已。,.,22,在平衡合成机制中，由于第二个终产物的过剩逆转反馈控制，所以，尽管存在反馈控制也能积累目的产物。,.,23,举例：,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰CoA,柠檬酸,草酰乙酸,天冬氨酸,黄色短杆菌中天冬氨酸与乙酰CoA的平衡合成,反馈抑制,逆转反馈抑制,丧失柠檬酸合成酶的突变株,.,24,所谓代谢互锁（metabolicinterlock），就是从生物合成途径来看，似乎是受一种完全无关的终产物的控制，它只是在较高浓度下才发生，而且这种抑制（阻遏）作用是部分性的，不完全的。,3.代谢互锁的利用,.,25,谷氨酸,谷氨酰磷酸,谷氨酸激酶,脯氨酸,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,赖氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,苏氨酸脱氨酶缺陷,草酰乙酸,ATP,黄色短杆菌异亮氨酸缺陷型生产脯氨酸,.,26,例：黄色短杆菌赖氨酸的合成调节,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,天冬氨酰半醛,二氢吡啶二羧酸,赖氨酸,高丝氨酸,蛋氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,乳糖发酵短杆菌赖氨酸及亮氨酸的生物合成,天冬氨酸激酶,二氢吡啶二羧酸合成酶,亮氨酸,反馈抑制,反馈阻遏,抗AEC+leu-,.,27,代谢互锁不仅具有抑制与阻遏作用，还发现具有激活作用。如：枯草芽孢杆菌色氨酸的生物合成途径中，氨茴酸合成酶的活性被组氨酸激活，使用枯草芽孢杆菌的抗5-氟色氨酸突变株生产色氨酸时，通过添加组氨酸使色氨酸产量由2g/L提高到3.4g/L。,.,28,4.优先合成（preferencesynthesis）的变换,底物A经过分支途径生成两种终产物E和G，由于a酶的活性远大于b酶的活性，结果优先合成E；E升高到一定浓度，抑制a酶，使代谢转向合成G，G量增加后抑制c的活性。,A,B,C,D,E,F,G,a,b,c,.,29,在分支合成途径的调节中，因为在分支点处的优先合成与反馈控制一起完成重要的功能，所以优先合成的转换会引起一种终产物的过剩合成。,.,30,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,天冬氨酰半醛,二氢吡啶二羧酸,赖氨酸,高丝氨酸,O-乙酰高丝氨酸,蛋氨酸,O-磷酸高丝氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,天冬氨酸激酶,高丝氨酸脱氢酶,高丝氨酸激酶,黄色短杆菌赖氨酸的合成调节,TD,反馈控制,加过量蛋氨酸,5g/L,突变活性降低1/3,20g/L,.,31,六、条件突变株的应用,像温度敏感性突变、链霉素依赖性突变和低温敏感性突变等，因环境条件的不同能显示突变型特性的改变，称为条件致死突变（conditionallethalmutation）。主要是蛋白质的结构基因发生突变。,.,32,温度敏感性突变,很多微生物可以在20-50温度范围内生长。通过诱变可以得到在低温下生长，而在高温下却不能生长繁殖的突变株，这样的突变即是温度敏感型突变。,.,33,温度敏感型突变的位置常发生在酶的结构基因上，致使一个氨基酸被另一个氨基酸代替。温度敏感突变株高温下酶失活，因而不能生长。改变温度，酶活性在0100之间变化，但是难以恢复到100野生型活性。,.,34,如果该酶是蛋白质，维生素或核苷酸生物合成途径上的酶，则该突变株高温下就是一种营养缺陷型。例：如果突变位置发生在为亮氨酸合成酶系编码的基因中，使翻译出来的酶对温度敏感，则高温时就不能合成亮氨酸，即成为亮氨酸缺陷型。,.,35,例如：,由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌经诱变处理得到温度敏感变异株Ts88，30培养时能正常生长，40时死亡,但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸(而野生型却受生物素的反馈抑制).在富含生物素的培养基