PCR引物设计ppt课件

.,生物信息学软件介绍,.,2,基因芯片相关软件序列分析软件RNA二级结构软件蛋白质二级结构软件限制酶切位点软件质粒绘图软件引物分析软件凝胶分析软件生物显微分析软件数据统计类软件文献管理软件,常用生物信息学软件,.,3,管理实验室数据及文献资料,查阅实验相关文献，对所研究课题的最新进展有一个基本的了解，从而确定自己的实验策略，同时，方便实验室结果的储存、管理和申报工作。常用软件：EndNote(可以在线查找Internet上的各种文献数据库，将查找到的资料保存入本地数据库，并自动生成格式化的参考文献清单插入各种文字处理软件）ReferenceManager（可以在线通过查找关键词搜索PubMed等多个数据库中的专业资料，同时保存查找的资料为本地文件，可直接在word中查找资料，并插入引用，在文章中对引用的文献可以格式化。）医学文献王（智能化网上检索、专业化文献管理和自动化嵌入参考文献三大特点，特长在中文期刊的系统化，也支持外文文献数据库）,软件功能,.,4,分析和处理实验数据和公共数据，加快研究进度，缩短科研时间,软件功能,随着实验的进行，就必须对实验过程中的DNA、RNA和蛋白质的信息进行各种处理，包括限制酶分析、引物设计、同源序列比较、质粒做图，结构域查找，RNA二级结构预测，蛋白二级结构分析，三维结构显示等方面的内容,.,5,限制酶分析,推荐软件：DNAssist1.0大多软件只对线性序列进行分析,那么cNNNNNNNNgaatt环状的序列就找不到EcoRI的位点。DNAssist1.0能很容易把这个EcoRI位点找出来DNAssist在输出上非常完美，除了图形、线性显示外，还有类似DNASIS的列表方式，列出有的位点（按酶排列，按碱基顺序排列）。VectorNTISuite亦是不错的选择,.,6,引物设计,PrimerPremier5.0（自动搜索）Oligo6（引物评价）VectorNTISuite（综合分析）PrimerExpress(实时定量PCR引物设计和探针设计）Omiga2.0DNAStarPrimer3（在线服务）,.,7,同源序列比对,NCBI的BlastExpasy的allignmentClustalXGeneDoc3.2VectorNTISuiteOmiga,.,8,质粒绘图,GeneConstructionKit2.0Winplas2.6PlasmidPremier2.02RedasoftVisualCloning2000SimVectorCloneManager,.,9,RNA二级结构,RNAStructure3.5RNAdraw,.,10,序列综合分析,VectorNTISuite8.0Omiga2.0DSgeneDNASISforWindows2.5DNATools5.1BioeditDNAMAN,.,11,蛋白分析软件,蛋白二级结构分析：ANTHEPROT4.5、Peptool、VHMPT（ViewerandeditorforHelicalMembraneProteinTopologies）、MACAW(MultipleAlignmentConstruction&AnalysisWorkbench,MACAW)三维结构显示：RasMol、Cn3D、CHIME2.6IE、POV-Ray3.5,.,12,凝胶分析软件,BandScan4.30：通用的电泳胶条带定量分析软件，手动、自动找到条带，手动的条带可以是无规则的，可以清除背景。进行分子量、百分比、质量、波峰等方面的定量分析。直接使用扫描仪，将数据输出到excel文件。Bandleader3.0：小巧的凝胶图像分析软件TotalLab2.0：一个全智能化的凝胶分析软件，对DNA、蛋白凝胶电泳图像、arrays,dotblots与colonies等图像可以进行很方便的处理PDQuest6.2.1：bio-rad公司一个分析2维凝胶并生成数据库的标准软件。使用它，可以同时分析100个凝胶图像，生成包含1000个凝胶图像的数据库。,.,13,DNASIS2.5tRNA二级结构预测,软件应用图例,.,14,Omiga2.0ORFMap,.,15,DNAStar之Protean对氨基酸的亲疏水性分析：helicalwheel图,.,16,PrimerSelect,.,17,Winplas2.6质粒构建,.,18,Atheprot5.0预测蛋白跨膜区域,.,19,Antheprot5.0预测信号肽断裂点,.,20,DNASIS2.5对蛋白编码区的预测,.,21,DNASIS2.5对蛋白编码区的预测(ORFList),.,22,DNASTARGeneQuest预测CDS,.,23,DNASIS2.5蛋白二级结构预测,.,24,Cn3D2.5显示1EQFA链三维结构,.,25,RasMol2.7显示1EQFA链三维结构,.,26,本次课程内容,引物设计：PRIMERPREMIER5.0文献编辑软件:EndNoteX4,.,引物设计实例分析,.,28,PCR原理概述,PCR技术又称聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction）技术，是一种在体外（试管、切片）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。,.,29,PCR原理,SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextension,.,30,PCR引物设计,引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补；其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。,.,31,引物设计需要考虑的因素,围绕这几条基本原则，设计引物需要考诸多因素，如：引物长度（primerlength）产物长度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)G值(internalstability)引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）错误引发位点（falseprimingsite）引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。,.,32,引物设计要点,一般引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp，不超过38bp，过长或过短都不合适。碱基随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。,.,33,引物设计要点,G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标，一般情况下，在Oligo5.0软件的G值窗口中，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间部分G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。分析其原理，引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合，因此5端与中间段的G值应较高，而3端G值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。,.,34,引物设计要点,引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构导致引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5kcal/mol引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构可能,.,35,引物设计要点,引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。如扩增编码区域，引物3端不要位于终止密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。,.,36,DNA/mRNA引物的区别,DNA,mRNA,.,37,UCSC:,基因搜索,/,.,38,输入待查询基因名称,.,39,.,40,目标基因,2020/4/30,.,41,基因组、mRNA、蛋白序列,.,42,.,43,2020/4/30,.,44,.,45,芯片检测结果,.,PRIMERPREMIER5.0使用说明,2020/4/30,.,47,安装Primerpremier5,2020/4/30,.,48,2020/4/30,.,49,2020/4/30,.,50,2020/4/30,.,51,2020/4/30,.,52,2020/4/30,.,53,2020/4/30,.,54,2020/4/30,.,55,2020/4/30,.,56,2020/4/30,.,57,2020/4/30,.,58,2020/4/30,.,59,2020/4/30,.,60,2020/4/30,.,61,2020/4/30,.,62,2020/4/30,.,63,2020/4/30,.,64,2020/4/30,.,65,.,File菜单中的Parameter命令可以对系统参数，PCR反应条件和程序打分系统进行设置，以帮助用户根据自己的特殊要求来进行引物设计，其中反应条件按照引物浓度，单价离子浓度，Mg离子浓度，Na盐浓度等。而打分系统是参照的以下公式：,根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。,2020/4/30,.,67,2020/4/30,.,68,2020/4/30,.,69,引物设计（PrimerDesign），酶切分析（RestrictionSites）和基序分析（Motif）,.,当一个基因被识别、其DNA序列被解读时，人们往往仍然无法弄清相应的蛋白序列是什么。这是因为在没有其它信息的前提下，DNA序列可以按六种框架阅读和翻译（每条链三种，对应三种不同的起始密码子）。阅读框的次序（+1,+2,+3,-1,-2,-3)。,.,创建新序列文件,2020/4/30,.,72,将模板序列粘贴进入,点击进入引物设计模块,.,最上面一层左面是5个控制按钮，用于实现引物设计中的各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑,显示模板和引物序列及二者间的配对情况的显示,显示两个引物的各种参数，包括给引物的打分，引物以及产物的起始位置、长度、Tm值、GC、简并性,有关于引物的二聚体结构、发卡结构、错配情况和引物间二聚体结构的预测,显示的是对PCR扩增有影响的结构的位置，结构细节和稳定能,.,根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定搜索引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。,.,20.4.30,广西医学科学实验中心xy,75,点击search,点击参数设置,.,GC夹,引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5末端。这一段有较强稳定性的5末端称为GC钳，它保证引物与模板的稳定结合。,2020/4/30,.,77,Degeneracy(多义性）：当设计多义引物时，尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性。应尽量避免3末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物的延伸。,3末端稳定性：引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5末端和相对稳定性较弱的3末端。如果3末端稳定性强，有可能在即使5末端不配对的情况下造成错配，形成非特异性扩增条带。,.,.,.,在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物搜寻界面中相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能存在的不利结构。,.,利用引物编辑窗口对程序自动找到的或手工找到的引物序列进行编辑，以便用户能在引物引入突变及加入特定的酶切位点，并对修改后的序列的二聚体结构、发卡结构和错配进一步评估。,.,除了以上的直观地对引物进行基本的设计和评估功能外，该程序还提供了多种数据报告，主要通过Report菜单和Graph菜单中命令来实现。,.,G是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。,.,引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kal/mol