蔬菜作物分子标记辅助育种ppt课件

蔬菜作物分子标记辅助育种（分子遗传图谱基础）,几种典型的分子标记,RFLPPCR-based:RAPDAFLPSSR,ISSRsSCARCAPSSNP,分子标记的特点,基于DNA序列单个碱基突变插入/缺失重排数量多,不受环境影响可在任何发育时期检测中性无位点间互作,分子标记的发展.,CAPACITY,1985,1990,1995,2000,DNAChips,Multi-SSRs,AFLPs,SSRs,RAPDs,RFLPs,?,分子标记的应用,遗传多样性与指纹分析种质资源的遗传关系遗传距离与杂种优势品种纯度分析与品种鉴别系统发生关系分析遗传与做图简单遗传性状数量性状(QTL),分子标记辅助选择单基因快速转育QTL转育基因聚合外源基因的渗入隐性基因的选择与操作早期选择图位克隆,A,a,B,b,X,a,a,b,b,不连锁-testcross,1,1,1,1,A,a,B,b,X,a,a,b,b,A,a,b,b,a,a,B,b,连锁-testcross,交换单株,交换单株,非交换单株,非交换单株,B,2,0,0,1,4,0,5,1,0,2/13gametesrecombined,连锁值的计算,双侧翼标记,增加准确性,Res,A,Res,A,B,90%,99%,10cM,10cM,10cM,选择的准确性,常用分离群体,F2BC1RILsBILsDHNILs,亲本选择,标记特定性状性状在亲本间具有多态性。基因组其他区域不是特别重要，但遗传上尽可能具有较大的差异。做图遗传上差异尽可能大。要求性状可充分表现,近源亲本还是远源亲本,近源亲本筛选标记的工作量大可以利用较少的代数转育到目的亲本一般只能用于一个特定亲本的转育,远源亲本筛选标记的工作量小转育需要的代数可能较多多数情况下可用于不同亲本的转育,F2,M3560;,M3461,10,M3658;,12,通过MAS进行快速转育,通过MAS快速获得重组单株,通过MAS进行回交转育需要考虑的几个因素,需要转育的基因组区段数量群体大小目标区域与其侧翼标记的重组频率每个转育循环需要选择单株的数量,理论上的限制,需要改良性状的遗传复杂性表型评价的准确性基因型与环境的互作评价上位互作的准确评价,实际应用上的限制,可分析的样品的数量每次添加新的种质资源都需要进行QTL确定在给定时间内可改良的基因型数量的限制,PCR标记,可早期取样快速的DNA制备可对大量样品进行分析,SSR(simplesequencerepeat),什么是SSR？,在真核生物基因组中均存在着由14个碱基对组成的简单重复序列（简称)，如()、()、()、()、()等，又被称为微卫星DNA标记（Microsatellite）或者SSLP（simplesequencelengthpolymorphism）是一种基于PCR技术根据其两侧独特的序列设计引物，进行扩增，再用琼脂糖凝胶或变性聚丙稀酰胺凝胶电泳分离产物，检测多态性的分子标记。,PCR（聚合酶链式反应）,历史：KaryB.Mullis,whowasawardedthe1993NobelPrizeinchemistryforhiswork,developedPCRin1985.原理：变性94、复性54和延伸72，经过多个循环（30-40），使产物的量达到模板量的106-1010倍反应体系：2个引物、模板DNA、Mg离子、dNTPs、缓冲液和热稳定性核酸聚合酶仪器：热循环仪,PCR示意图：,PCR示意图：,PCR示意图：,2n-1-2n个,扩增产物是否正确？,SSR的发展简史,对的研究始于动物基因组。1974年等在寄居蟹中发现了一类串联重复序列()。1982年,等在人心肌肌动蛋白(-25)的内含子中发现了一个重复25次的()序列。随后，在其它生物的研究中也发现了相似的串联重复序列。首先在人类和小鼠中建立了以为主的分子连锁图。在农作物中这一技术应用相对较晚，目前已开展标记研究的作物有水稻、小麦、玉米、大豆、大麦、油菜等。,SSR的类型,根据核心序列排列方式的不同可将分为：完全型(perfect)指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的例如：ATATATATATATATATATATATATATATATATAT不完全型(imperfect)是指在的核心序列之间有3个以下的非重复碱基,但两端的连续重复核心序列重复数大于3例如：ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATAT复合型(compound)是指2个或2个以上的串联核心序列由3个或3个以上的连续的非重复碱基分隔开,但这种连续性的核心序列重复数不少于5例如：ATATATATATATATGGGATATATATATATAT等研究指出,这3种类型的人类基因组中所占的比例差异很大,分别为64%,25%和11%。3种类型内完全型是标记中应用较多的一种类型。,SSR的类型,根据核心序列碱基数目的不同,又可将分为：单碱基重复型、2碱基重复型、3碱基重复型、4碱基重复型。各种在植物基因组中的丰度(即频率)不同，（)是植物基因组中最丰富的,然后依下列顺序递减:()(),()(),()(),()(),()(),()(),()(),()()以及)()。同一类型内，核心序列碱基种类不同的，其丰度也差别很大。和从和查询了植物序列，2碱基重复型中(10)，各种的相对频率是:()=74%,()=24%,()=1%,()=03碱基重复型(7)中，各种的相对频率是:()=27%，()=25%，()=12.5%，()=10%，()=7.5%，其它各种均小于5%。,具有重复性高多态性丰富操作简单需要DNA量少广泛分布于整个基因组检测获得的多态性位点多遗传变异信息量大共显性遗传等特点,SSR的优点：,SSR在植物基因组中的分布,广泛分布于各种真核生物的基因组中，呈随机分布，大约每隔1050就存在一个。但是相对来说编码区分布要少于非编码区。哺乳动物中的的数量大约为植物中的56倍，在植物中，平均23.3就有一个。双子叶植物中的数量大于单子叶植物，前者两个之间的平均间距为21.2，后者为64.6kb核中的数量多于细胞质中的。绝大多数单碱基重复型及2碱基重复型存在于非编码区，3碱基重复型多位于编码区。,SSR在植物基因组中的分布,对的检索结果及对主要农作物数量的预测,SSR的功能,部分SSR位于编码区，编码氨基酸有些SSR染色体的末段，保护DNA完整性、避免融合及丢失的功能部分SSR位于调控区，提高和降低临近基因转录速率的作用SSR是基因重组的热点，变异的来源之一部分SSR具有产生转录启动复合物和活化染色体的功能大多数SSR没有明确的生理功能,SSR分析的步骤,获取引物PCR扩增电泳数据处理,获取引物,从数据库或相关发表文章中查询Genebank，EMBL，DDBJ等（适合得到序列信息丰富的物种）使用近缘物种的引物，SSR在属内种间甚至在科内都是保守的，因此可以接见相近物种的SSR引物，通过构建基因文库，克隆测序分析SSR两段的保守序列，筛选引物位点；SAGE方法构建串联基因文库，测序分析SSR两端的保守序列,获取引物,构建基因文库，筛选引物位点其基本程序包括:对基因组进行酶切，构建小片段(300800)基因文库用含有特定序列的探针去筛选阳性克隆；对阳性克隆进行序列测定。由于两侧的序列在同一物种间是高度保守的，因此一旦获得了合适的位点序列，就可根据侧翼序列设计高度专一性的引物(一般1624)进而对基因组和克隆DNA进行扩增，检测验证.,基因文库构建,6bpcutter:EcoRI,BamHI,RstIorPstI,4bpcutter:MobIorSau3I,Size:2-5kbisokalso,引物设计软件,On-linesoftwarePimer3(/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)FastPCR(http:/www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/manual.htm)On-handsoftwareDNAStar,可用引物的标准,产物长度：80-300bp退火温度：40-60度引物3端有1-2个G/C单引物内部少于3个核苷酸的互补；两个引物间少于连续3个核苷酸的互补设计引物对基因组和克隆进行PCR扩增，得到大小一致的片段产物片段和期望片段大小基本一致产物由一个片段组成,SSR分析的步骤,获取引物PCR扩增电泳数据处理,PCR扩增,优化不同引物对的专一反应条件：缓冲液中的的浓度循环次数优化PCR复性温度（FastPCRprogram）Tmopt=0.7Tmproduct+0.3Tmprimer-14.9Tmproduct=81.5+16.6lgK+0.41GC%-675/lwhereK+issaltmolarconcentration,GC%isthepercentofGsandCsinthesequence,andlisthelengthofthesequence.,dH形成螺旋的焓；dS熵,；R气体常数(1.987cal/Cmol)；“c”核酸的摩尔浓度(经验公式计算,W.Rychliket.al.1990),(默认值250pM)；K+盐摩尔浓度(默认值50mM).,SSR分析的步骤,获取引物PCR扩增电泳数据处理,电泳,用于产物分离的电泳主要有：琼脂糖电泳（高浓度2.5%）聚丙烯酰胺变性序列胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳。由于扩增的片段短(一般小于300)，基因间的差异小(一般为几个)，故通常使用分辨率高的聚丙烯酰胺凝胶电泳。对扩增产物的显色方法有：同位素放射性自显影法荧光染料标记法溴化乙锭（)显色法银染法，目前利用较多的是银染法,SSR分析的步骤,获取引物PCR扩增电泳数据处理,数据处理,位点的共显性遗传应产生1条(纯合子)或2条(杂合子)主带。一般予父本赋值1，杂合子赋值2，母本赋值3。记录各材料带型。将其转化为0，1数据，运用计算机程序进行相关的遗传分析。在数据处理中，通常用(polymorphisminformationcontent)来表示信息含量，称为多态信息含量。=1-=12，其中表示第个等位基因对标记的频率。影响值的大小的因素主要有群体中现有等位基因的数目、群体中等位基因的分布及串联重复单位的数目()，值的范围从0(=10)到0.8(=24)。值大,说明该标记可检测到的等位基因的数目多，即可区别不同基因型的能力强,相应该标记的利用价值就高。最高的预期值是那些最长的、中间没有被替换的重复序列.,SSR的应用,遗传图谱构建(rice500ssr;human5,264;mouse6580)种质鉴定遗传多阳性分析MAS（markerassistantseletion）标记辅助选择基因定位(personalcomunication,louping)分析系谱分析亲缘关系鉴定等,SSR存在的问题,新SSR标记筛选步骤复杂、费事、费力针对不同的引物对，要获得最佳的效果，需要进行复性温度的，Mg离子浓度及反应循环的优化，操作者需要一定的实验基础,SSR-relatedtechniques,VNTR(variablenumbertandemrepeat),数量可变串联重复，MinisatelliteDNAwithrepeat9-80bp,7-80timerepeatISSR（InterSSR),简单序列重复区间扩增，1994年SSR-anchorPCR（SSR锚定PCR）cSSR(codingSSR),又称EST-SSR,AFLPAmplifiedFragmentLengthPolymorphism,LaboratoryofBiotechnologyInstituteofVegetables,0,E40/M49_5;,8,pO87E2;,10,pN86E1;,SSR17;,13,pO85J1;,pW194E1;,15,E40/M50_6;,17,E32M48_10;,E33M52_1;,E33M48_6;,E33M49_14;,E33M49_10;,E31M48_3;,E33M49_15;,E32M47_4;,E31M49_7;,20,E40/M49_6;,E33M49_6;,E33M52_5;,E33/M62_1;,21,E31M49_19;,22,E31M51_3;,23,E31M50_11;,24,E35/M50_2;,26,E31M50_5;,27,E32M47_2;,28,E32M49_10;,E32M49_2;,30,SSR93;,32,E33/M60_9;,34,E31M50_3;,38,E33/M62_11;,42,E34M48_11;,44,E36M50_1;,46,E31M51_9;,48,E40/M50_3;,58,E33/M60_6;,E38M50_6;,E33M51_8;,59,E31M49_10;,61,E35/M51_1;,63,pN97J2;,67,E33/M60_1;,71,E33M47_4;,76,E33M47_8;,E33M47_7;,82,pO43J1;,88,1,E40/M47_7;,0,E38M50_5;,1,pR72J1;,4,E33/M61_3;,E31/M47_3;,7,E40/M47_4;,10,E33/M61_2;,11,SSR19;,12,E32M51_3;,E35/M50_10;,E36M48_5;,14,E32M51_4;,E32M51_5;,E32M47_11;,E36M50_3;,E32M49_1;,E38/M48_1;,E33M49_5;,E32M50_3;,E33/M50_6;,E40/M48_7;,16,E33M49_20;,E35/M50_11;,18,E32M52_1;,E38/M48_3;,19,E33/M62_2;,24,E32M47_12;,E37M50_5;,25,E33M49_8;,28,E34M48_4;,30,E31M49_3;,31,E35/M51_3;,33,E33M49_23;,34,pO17E1;,36,E37/M48_2;,40,E32M49_4;,41,pR86J1;,42,pN180E2;,49,E32M50_2;,51,labi8E1;,53,C339E2;,56,pN121E1;,60,E31M52_2;,63,2,E33M48_3;,0,E32M51_7;,5,pW177E1;,12,E32M49_5;,E32M49_6;,17,E32M51_1;,20,pN194J1;,24,E33M48_4;,29,pW143E2;,30,pO147E1N;,34,E31M48_5;,36,pN120J1;,40,E33M49_21;,pN202E1;,41,E38M50_1;,pN99E1NP;,43,pW205J1;,45,pO98E1;,46,pN66E2;,47,E31M50_8;,48,E34M48_1;,50,E31M49_17;,51,E34M49_7;,54,E33/M60_5;,E33M52_12;,55,E37/M48_1;,E31M49_1;,E33M52_10;,E33M52_9;,E33M48_9;,56,E37/M48_3;,E37/M50_5;,58,E32M49_9;,E32M48_13;,E32M48_2;,59,E33/M62_3;,60,E40/M50_10;,61,SSR74;,E37M50_1;,63,E31M50_2;,65,E36/M49_5;,71,3,chrom4,Chrom5,chrom2,Linkagegroup4-6,E38M50_3;,0,E35M48_8;,4,pW200E2;,13,E32M48_11;,16,E31M49_12;,18,E37/M49_1;,20,pW153J1;,23,E33M48_1;,26,pN102E1;,28,LEW6E1;,29,pN105E1;,32,E33M52_3;,34,E33M49_13;,36,E32M50_6;,E32M50_7;,38,pW111J1;,41,pR116E1N;,44,BN12a;,45,bn12;,E33/M62_6;,49,E31M49_4;,50,SSR54;,52,E31M49_13;,53,E33/M61_1;,58,pW143J1;,60,E32M47_10;,E38M62_4;,63,E32M49_7;,64,pN213J2;,67,E38M50_2;,76,pW172E2;,78,SSR62;,80,pW142J1;,82,E31M52_3;,84,E31M51_13;,88,E33/M50_2;,92,pW146J1;,93,pW102J1;,96,E37M50_6;,98,E38/M58_2;,104,E37/M47_4;,106,E31M49_9;,107,E40/M50_2;,E36M50_7;,E35/M50_5;,E33M48_15;,E32M52_5;,E32M52_2;,E38/M58_1;,E33M49_3;,108,E31M51_11;,109,E32M51_14;,112,E34M49_5;,115,E38/M48_2;,118,E31/M47_4;,125,E31M51_1;,130,E38/M48_7;,E38M50_7;,E37M50_7;,132,E33/M50_4;,134,flower;,141,E33M51_5;,144,E38M50_4;,148,AC-CACE18;,153,pO43E1;,156,AA-CATE02;,160,E33M48_7;,162,4,E33/M50_7;,0,E33/M60_14;,4,E32M61_9;,13,AC-CTCE01;,16,pW101E4N;,18,E33M47_9;,21,pR64E2;,24,E34M50_2;,26,E38/M47_4;,28,E31M50_7;,32,E31M49_16;,E32M49_12;,33,E33M49_12;,34,E33M49_11;,E33M49_22;,36,E33M47_11;,E32M49_11;,E33M47_6;,38,E32M52_3;,40,E31M48_1;,41,E32M50_5;,E32M50_1;,45,E31M48_6;,E31M50_10;,49,E31M48_4;,50,SSR79;,53,E35/M54_4;,E33M52_6;,54,