蛋白质研究技术sPPT课件

.,1,1.蛋白质分离纯化(separation&purification),三阶段纯化策略(纯化所涉及的具体步骤最终要取决于样品的性质，但具有共同的可参考阶段)-捕获阶段初步澄清、浓缩和稳定目标/靶蛋白-中度纯化阶段除去大多数杂质，包括非靶蛋白及核酸等-精制阶段除去残余的痕量杂质,可依据蛋白质的特殊性质而采用不同的分离方法,.,2,所用步骤及数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途,.,3,-透析/超过滤法常用于去除各种盐类和小分子杂质(eg.aftergrade-purifiedbyammoniumsulfate),.,4,2.层析(chromatography),-逆流分溶原理,.,5,-离子交换层析(电荷状态),-混合物中不同组分对树脂中带电基团的亲合力将受到溶液pH(决定各组分的电离状态)和游离盐离子浓度的影响-对阳离子交换剂亲合力低(电负性更强)的组分流经层析柱的速度要相对更快一些-与阳离子交换剂结合得最紧密(电正性最强)的组分则可通过采用盐浓度更高或不同pH的缓冲液将其最后洗脱,P5-18a,AAselutionorderatpH3:acidic(A0)neutral(A+)basic(A2+),阳离子交换剂的基质为电负性，可交换阳离子,.,6,-分子筛/排阻层析(颗粒大小),-亲合/吸附层析(配体亲和力),5-18b/c,.,7,3.电泳(electrophoresis),带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动之现象,-电泳介质现多采用各种凝胶(eg.琼脂糖、丙烯酰胺等)-介质pH一般维持在碱性区，使蛋白质大多带负电荷而向阳极迁移-蛋白质的迁移与其质量和电荷数密切相关,.,8,-SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳),SDS是阴离子表面活性剂，能破坏氢键和疏水互作并与蛋白分子结合(1.4gSDS/gprotein)，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过蛋白质分子原有的负电荷，从而掩盖了不同蛋白质之间原有的电荷差别，使蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量的大小,分子量在15,000200,000之间时，蛋白质的电泳迁移率与其分子量的对数值正相关,.,9,-等电聚焦电泳(IFE),利用特定两性电解质构建的缓冲液在电场作用下于凝胶内沿电场方向建立的pH梯度，使样品中具有不同pI的各种蛋白质最终均迁移至凝胶中相应的pH处而达到分离之目的,.,10,可以将相对分子质量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而相对分子质量不同的蛋白质分开,-双向电泳(two-dimensionalelectrophoresis),.,11,4.氨基酸序列分析,FrederickSanger(1918-),theonlyonewhogotNPforCwice(1958&1980),-各种蛋白质均具有其独特的AA序列，可决定多肽链以何种方式折叠、盘绕成独特的3D构象(功能基础)-AA序列异常有可能导致遗传病(by1AA1/3)eg.sicklecellanemia:链Glu6Val6-不同物种的相似功能蛋白质常具有类似的AA序列eg.Ser-proteases的催化三联体泛蛋白的全部76AA对果蝇和人均完全相同,.,12,P6-3,对酸水解远比肽键稳定,短肽可采用自动法测序,确定肽链的AA组分,鉴别肽链的N-端残基(Sangerreagent),鉴别肽链的N-端残基以Edman降解法测定短肽链的AA序列,PTC基,PTH-Aa(270nmabsop.),DNP-Aa,(cf.Fig.2-32),(cf.p42),苯异硫氰PITC,PTC基的引进只降低1st个肽键的稳定性,TFA(三氟乙酸)cleavesN-terminalAAbutleavesrestofpolypeptidechainintact,.,13,氨肽酶法,Ala,Val,Gly,羧肽酶法,-肽链末端亦可用酶法测定,.,14,-Edman法的测定长度取决于每轮循环降解的有效率,以N-末端为Gly-Pro-Lys-的肽链为例，如果每轮循环切除的有效率为97%，则,1stGlyPro-Lys-97%Gly-Pro-Lys-3%,cyclePTH-AAshortenedpeptide,2ndPro97%Lys-97%Gly3%Pro-Lys-2.9%Gly-Pro-Lys-0.1%,3rdLys97%Pro2.9%Gly0.1%,目前的降解有效率99%，可一次性连续测定出6070AA序列的肽段,PehrEdman1916-1977,.,15,大蛋白需分解成小肽段后再测序,-断开二硫键过甲酸氧化/二硫苏糖醇还原-分割多肽链eg.胰蛋白酶+溴化氰-肽段测序Edman降解法-肽段整合比较两/多套肽段的重叠肽序列-确定二硫键部位断裂二硫键前、后的电泳图谱比较,(cf.p43),在以常规法确定了完整肽链的AA组成(酸水解)和N-末端残基(DNFB)的基础上,.,16,5-26,Cys,断开二硫键,-过甲酸氧化-二硫苏糖醇还原+碘乙酸保护,(cf.p44),磺基丙氨酰(负电荷增加),.,17,t5-7,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,溴化氰(CNBr),(cf.p45),常用的分割肽链法,分割原则：-断点少-专性强-反应率高,肽酰高丝氨酸内酯(cf.Fig.2-30),.,18,5-27,两个Cys仅有一种形成二硫键的可能,DNP-Glu(E),-Glu为N-末端残基,trypsin切割三次生成四个肽段CNBr切割两次生成三个肽段,C-1,C-2,Similarly,38AA,.,19,用互补DNA法推断蛋白质的AA序列,待测定蛋白质作为抗原,抗体,合成抗原的多核糖体,mRNA,cDNA,氨基酸序列,mRNA,Protein,分离,反转录,测序推断,免疫处理,沉淀,.,20,W1.11,多肽液相合成,X常用苄氧甲酰基,Y常用叔丁酯,用PCl5激活参与肽键形成的羧基，现在多采用更温和的叠氮、混合酸酐和活化酯法,EmilFischer1852-1919,(NPinChemistry,1902),5.肽的化学合成,.,21,羧基挂接,氨基去保护,缩合,释放,羧基活化,保护氨基,P6-13,多肽固相合成,BruceMerrifield1921-2006,二环己基碳二亚胺,(NPinChemistry,1984),H2N,1962synthesizedbradykinin(9AA)in27h(ty.85%),.,22,Protecta-aminogroupwithFmoc(9-fluorenylmethoxycarbonylgroup),LINKAGECANBECLEAVEDBYMILDBASE,甲氧羰基芴(二苯并五环),P6-12,.,23,t5-8,化学合成肽的主要限制因素之一在于每轮合成的效率,-化学法合成出100AA的肽段需要数天，而(细菌)细胞的生物合成仅需5min,.,24,要点提示,可以依据各种蛋白质的溶解度、电荷、大小以及结合特异性上的差异，从生物资源中提取纯化蛋白质；常用法包括各种层析及电泳技术柱层析可根据固相介质的不同划分：凝胶层析按照蛋白质相对分子质量的大