第三章核酸技术.ppt

第三章核酸技术,核酸的分离和纯化核酸电泳染色体DNA电泳DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制DNA的连接PCR技术分子杂交技术核酸序列的测定,第一节核酸的分离和纯化,一、一般程序1、供体的核酸分离供体细胞培养收集(菌体)细胞细胞破碎分离总DNA分离细胞器分离总RNA分离细胞器DNARNApoly(A)RNA特异性RNA染色体DNA(组建基因组文库),2、载体DNA分离载体DNA感染或转染细胞（病毒型）转化细菌细胞（质粒型）分离病毒颗粒培养转化细胞、收集菌体病毒载体DNA分离与纯化破碎细胞质粒DNA分离与纯化3、DNA片段的分离DNA限制酶切凝胶电泳分离特定DNA片段的回收,4、质量评估1）凝胶电泳2）光密度值测定3）限制酶切分析二、细胞裂解1.酶法：利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂使原生质体裂解。1)细菌：溶菌酶2)酵母：蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase等3)丝状真菌：Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶4)植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满足酶的最佳反应条件。,2.机械法1)压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌（芽孢和G+球菌除外）2)射击破碎法：Braun破碎机，搅切器（blender），混合器（mixer），0.1-0.45mm玻璃球3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（0.10.45mm）同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末4)反复冻融法三、DNA的分离与纯化1、供体DNA的分离与纯化要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。1)基因组大小：,染色体细菌33004200kb酵母15,000kb果蝇1.28x105kb人3x106kb植物2x1051x108kb天花病毒288kb痘病毒196kb质体几100以上kb,线粒体藻类线状15kb酵母环状1978kb植物环状100150kb动物(扁虫到人)环状1518kb锥虫网状6000kb(幼体)短膜虫网状30,000kb(幼体)(Kinetoplast）,叶绿体双子叶植物121（菠菜）154kb（豌豆）单子叶植物151（玉米）182kb（浮萍）藻类132（裸藻）191kb（衣藻）,2)CsCl密度梯度离心上清液加入固体CsCl与EtBr溶液室温下超速离心(45,000rpm）16小时穿孔取出DNA（320nm）异丙醇抽提溴乙锭缓冲液透析除去残余CsCl两倍体积冷乙醇沉淀DNA离心、洗涤、干燥*两种方法比较：CsCl法操作步骤少，分离DNA分子量大，耗财多，且需超速离心机。苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使DNA分子断裂。若小心操作，所获DNA亦符合要求。*上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤.可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液。.使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心.使RNA分离：RNase处理或超速离心.使DNA与其它可溶物分离,2.载体DNA的分离与纯化1)质粒载体DNA的分离关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开原理：质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA抽提过程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持超螺旋构型,方法：.超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型.变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法上述方法亦可用于ss环状病毒DNARF型的分离,质粒DNA的氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体）2)噬菌体载体DNA的分离纯净病毒颗粒病毒载体DNAM13mp载体可采用质粒DNA的分离方法,二、RNA的分离与纯化1.制备RNA的关键防止内外源RNase的作用1)RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围;抗高温严寒(065均具活性）；抗变性剂2)解决办法：外源RNase高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者带手套内源RNase高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等2.总RNA的制备根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：1）热苯酚抽提法2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍3）LiCl/尿素法,其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。,3.多聚核糖体RNA的制备1)多聚核糖体的分离超速离心法（30-40万g，离心2-3h）镁盐沉淀法（0.1MMg+）分级分离法分离特异性多聚核糖体,i.结合与游离核糖体的分离，这种方法可避免溶酶体破裂。ii.核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的多聚核糖体iii.核糖体免疫沉淀法*直接免疫沉淀法新生肽链+抗体蔗糖密度梯度离心*间接免疫沉淀法新生肽链+抗体+抗-抗体（二抗）不可溶复合物离心分离,*免疫亲和层析法新生肽链-抗体复合物不溶性交联抗原基质亲和层析柱吸附洗脱免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为1%的mRNA，但必须使用高纯度的抗体，不能发生交叉反应和污染核酸酶2)多聚核糖体RNA的分离纯化多聚核糖体+SDS蔗糖密度梯度离心或蛋白酶K-苯酚抽提4.RNA的分级分离1)分子量大小分级分离i.蔗糖密度梯度离心ii.凝胶电泳2)核酸序列分级分离i.分子杂交法：适用于同源性很高的RNA的分离DNA分子变性结合到NCFRNADNA杂交洗涤洗膜乙醇沉淀,ii.亲和层析法：低聚dT纤维素:用于poly(A)较长的mRNA；多聚U琼脂糖:用于poly(A)较短的mRNA（S大显然，要使一个DNA样品中不同大小的DNA分子分离，脉冲时间应选在最大DNA分子所需的上限。二脉冲场凝胶电泳的种类1正交场脉冲凝胶电泳（OFAGE）利用两个或多个交变电场，使200-3000kb的DNA分子发生分离，其电极排列可以是双向非均匀，单向非均匀等。,脉冲场凝胶电泳原理图,北,南,脉冲场电泳常规电泳两组电极，排列不均匀;一组电极，电场方向不变，电极排列均匀，定时改变电场方向，DNA分子的净DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳移动方向与两电场呈45o，在电泳过过程保持电压稳定。常规方法制备DNA程中，电压有时可随时间的增加而样品增加，制备DNA样品与常规方法不同,2.场倒置凝胶电泳（FIGE）利用常规电泳槽进行电泳，但电场方向则是周期性地发生倒置，其正向和反向的脉冲时间长度之比为3或其它比值。该法可使15-700Kb或以上的DNA分子发生分离。为了克服同移动现象产生（即不同大小DNA分子一起移动），可以采用转换时间递增法（swiching-intervalramps）,即由电泳开始时的短脉冲时间逐渐递增到电泳结束时的长脉冲时间。如开始时为60：20，结束时可为180：60。上述两种方法也可联合使用，使一些很难分开的大分子DNA分离。3.CHEF(Contour-ClampedHomogeneousElectricFields)动态调控闭合均一电场电泳,场倒置电泳,CHEF(动态调控闭合均一电场电泳),各种脉冲场凝胶电泳技术的比较方法染色体带最大带最小带动态调节直道均匀电场液体样品机械转换CHEF1512000kb88bp是是是是不OFAGE139000kb5000bp不不不是不TAFE139000kb2000bp不是不不不FIGE112000kb200bp不是是是不RFGE15?200000bp不是是不是,三影响染色体DNA电泳的主要因素1染色体的结构2电泳槽电极的构型3电压：它与脉冲时间成反比4脉冲时间：经过实验选择适合于某种生物染色体DNA完全分离的最佳脉冲时间5其它因素：温度，离子强度等,四染色体DNA样品的制备染色体DNA电泳的关键之一是获得完整的DNA分子，其制备方法有：1固体块法细胞培养，收集，洗涤，细胞悬液与细胞壁裂解酶液和低熔点琼脂糖凝胶混合倒平板复盖裂解酶缓冲液细胞壁裂解过夜除去缓冲液加入去污剂和蛋白酶K反应过夜换0.5MEDTA，4保存,2微球法制备细胞悬液与石蜡油和低熔点琼脂糖凝胶迅速混合，形成小球冰浴迅速冷却离心，洗涤加入原生质体形成液，37反应至细胞壁裂解加入裂解液501h离心，小球保存于0.5MEDTA，43加样切一小块样品凝胶块或吸取适量微球，置于电泳用凝胶块的样品孔中，用少许低熔点琼脂糖凝胶使样品与整块凝胶为一体，每一样品孔应含0.1-5gDNA样品4.限制酶切加样前取适量样品，置于EP管中，加限制酶缓冲液和限制酶进行酶切,五染色体DNA电泳的用途