免疫分析法 PPT课件

免疫分析法,主讲人：xx,1,概要,Sectionheader,Sectionheader,Sectionheader,前言,免疫分析法简介,应用与展望,免疫分析法,致谢,2,前言,前言,免疫学是研究免疫系统的结构与功能，了解其再免疫应答反应中对机体有益的防卫功能和有害的病理损伤的机制，研究有效的免疫措施，实现以防病，治病为目的的一门现代医学学科。自六十年代竞争分析原理提出，定量免疫获得巨大的进展。下面简要介绍免疫分析：,3,免疫分析法简介,简介,什么叫免疫分析？它是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术手段。抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内，也可以发生在体外。在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于抗原或抗体的检测，用于免疫学诊断。,4,免疫分析法简介,简介,可逆性,比例性和反应阶段性,特异性,5,免疫分析法简介,简介,特异性,特异性：抗原与抗体结合反应的专一性,分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性,6,免疫分析法简介,简介,可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体，解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。,影响因素：抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结合越牢固，越不易解离环境因素对复合物的影响pH、离子强度,7,免疫分析法简介,简介,比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系,抗原抗体反应比例性示意图,前带(prezone)：抗体过量后带(postzone)：抗原过量等价带(equivalencezone)：抗原抗体比例合适,8,免疫分析法简介,简介,第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象,9,免疫分析检测,分析检测,免疫分析检测免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。,10,免疫分析检测,分析检测,免疫学检测历史演进,放射免疫检测（兴起于20世纪70年代),酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用）；,以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术（20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。,11,免疫分析检测,分析检测,技术的分类,放射免疫技术按示踪物及荧光免疫技术标记种类分为酶免疫技术化学发光免疫技术金免疫技术按测定物反应体系匀相免疫测定的物理状态分为非匀相免疫测定,12,免疫分析检测,分析检测,放射免疫分析RIA,放射免疫分析是以放射性核素作示踪剂的标记免疫分析方法，具有高度的灵敏性，特异性和精确性，特别适用于激素，多肽等含量微少物质的超微量分析。但由于核素的放射性对人体有一定的危害性，必须加以防护，核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员须经过特殊训练。另外，由于核素有半衰期，试剂盒的货存期较短，因而放射免疫分析在应用中有诸多不便之处。,13,免疫分析检测,分析检测,采用标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag)竞争性结合有限量特异性抗体（Ab)的反应。,14,免疫分析检测,分析检测,荧光免疫技术,荧光免疫技术的基本原理利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上以一定的条件与标本中的待测抗原特异性结合，通过高发光效率的点光源，经过滤色板发出一定波长的光，使标本结合的荧光素激发而产生荧光，借助荧光显微镜来进行观察，可以判断待测抗原或抗体的有无。,15,免疫分析检测,分析检测,常用荧光物质,1、异硫氰酸荧光素（FITC)最大吸收波长为490495nm,最大发射波长为520530nm,可呈现明亮的黄绿色荧光。2、四乙基罗丹明（RB200)最大吸收波长为570nm,最大发射波长为595600nm,呈桔红色荧光，可与FITC的翠绿色荧光形成鲜明的对比，常用于双重标记或对比染色。,3、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC)最大吸收波长为550nm,最大发射波长为620nm,呈橙红色荧光。,16,免疫分析检测,分析检测,4、藻红蛋白（R-RE)最大吸收波长为565nm,最大发射波长为578nm,可与FITC一起共用488nm激发光，常用于双色免疫荧光染色。5、镧系螯合物6、酶作用后产生荧光的物质（荧光底物）,17,应用与展望,应用与展望,放射免疫分析（RIA）的应用,放射免疫分析由于敏感度高、特异性强、精密度高、并可测定小分子量和大分子量物质，所以在检验医学中应用极为广泛，常用于测定各种激素（如甲状腺激素、性激素、胰岛素等）、微量蛋白质、肿瘤标志物（如AFP、CEA、CA125、CA199等）和药物（如苯巴比妥、氯丙嗪、庆大霉素等）等。各种检测项目均有试剂盒供应，而且仪器设备并不昂贵，所以在国内被广泛采用。,18,应用与展望,应用与展望,免疫荧光技术在医学检验中的应用1、荧光抗体技术在临床检验上已用作细菌，病毒，和寄生虫的检验及自身免疫疾病的诊断等方面。2、免疫荧光间接染色法可用于测定血清中的抗体，用于流行病学调查和临床回顾诊断。其突出特点是能以简单方法同时检测抗体和与抗体其特异反应的组织成分，并能在同一组织中同时检查抗不同组织成分的抗体。,19,应用与展望,应用与展望,酶免疫技术,酶免疫技术（EIA）是目前临床应用最多的一种免疫分析技术。主要原理是用酶标记的抗体（或抗原）用于免疫学反应，并以相应底物被酶分解的显色反应对样品中的抗原（或抗体）进行定位分析和鉴定；亦可根据酶催化底物显色的深浅，测定样品中待测抗原或抗体的含量。,20,应用与展望,应用与展望,非均相酶免疫分析,均相酶免疫分析,非均相液相酶免疫分析,非均相固相酶免疫分析,以聚苯乙烯制品作为载体的酶联免疫吸附实验-ELISA,酶免疫分析技术,根据抗原抗体结合反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物，分为非均相酶免疫测定和均相酶免疫测定,21,应用与展望,应用与展望,发光免疫技术,发光免疫分析法,分类：光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。生物发光：反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。化学发光：是指在某些特殊的化学反应中，反应的中间体或产物由于吸收了反应释放的化学能而处于电子激发态，当其回到基态时伴随产生的光辐射现象。,22,应用与展望,应用与展望,新型免疫分析法,分子印迹技术分子印迹技术利用化学手段合成一种高分子聚合物一分子印迹聚合物(molecularlyimprintedpolymer，MIP)，MIP能够特异性吸附作为印迹分子的待测物，在免疫分析中可以取代生物抗体，被科学家誉为“人工抗体”。,23,应用与展望,应用与展望,实例1,2007年北京化工大学的老师在研究了以杀虫剂乐果为模板分子，制备了乐果印迹聚合物，并用该印迹聚合物装填的固相萃取柱对茶叶中的农药乐果进行了分离纯化，获得了满意的效果，加标乐果在柱中的回收率达100。,24,应用与展望,应用与展望,流动注射免疫分析为提高免疫分析的分析速度和自动化程度，自20世纪80年代中期以来，国外出现了一种新的免疫分析法一流动注射免疫分析法(flowinjectionimmunoassay，FIIA)。FIIA综合了两者的特点且可以计算机控制缓冲液的流速、自动进样、检测器的检测及数据处理，具有一些突出的优点，在临床生物样品的检测、低分子药物浓度的临床监测及环境污染物如农药及其代谢物的含量测定等方面具较广的应用前景。这种分析方法具有分析时间短、需要样品量小和操作简便等特点。利用FIIA对一些样品分析，测定耗时不足1rain,25,应用与展望,应用与展望,免疫-PCR技术免疫PCR方法(immunopolymerasechainreaction，I-PCR)是Sano等于1992年将免疫学反应和PCR技术相结合而创建的一种新的检测技术，同时具有抗原一抗体反应的特异性和PCR扩增技术的高效性。它运用PCR强大的扩增能力来放大抗原一抗体特异性反应的信号，使实验中只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到1至数个抗原分子。目前，国内外报道的I-PCR的敏感性一般比现行的ELISA法高1O-108倍。目前主要用于检测肿瘤标志物、细胞因子、神经内分泌活性多肽、病毒抗原、细菌、酶、支原体、衣原体等微量抗原。,26,应用与展望,应用与展望,27,应用与展望,应用与展望,多组分免疫分析多组分免疫分析技术(Multi-analyteimmunoassay，MIA)现在有两种设计方式：多探针标记法，它基于用不同标记物对多种抗原或半抗原标记，用竞争法测定各物质的量；多组分定位包被空间分辨分析法，即利用空间的不同位置标记同种标记物来测定，在不同的固相体系或同一固相载体上的不同反应区带上包被不同抗体，用于固相免疫同时测定。目前，该法已取得了相当成功的应用成果。,28,应用与展望,应用与展望,药物安全问题已成为21世纪消费者面临的首要问题。为了保证药物的安全，就需要有快速、灵敏的检测