苯酚法提取RNAppt课件

苯酚法提取酵母RNA,小老师：吕留帅邹建指导老师：肖靓,1,基本原理,细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧烈振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。,2,本实验采用的0.15mol/L缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离，而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离；用酚处理时DNA-蛋白复合物变性，在低温条件下从水相中除去，这样得到的RNA制品中混杂的DNA极少。用氯仿-异戊醇继续处理RNA制品，可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA不仅纯度高，而且多呈自然状态，可供继续研究之用。,基本原理,3,主要试剂：,（1）SDS-缓冲液：0.3SDS，0.1mol/LNaCl，0.05mol/L乙酸钠，用乙酸调到pH5.0。,SDS,NaCl,乙酸钠,4,主要试剂,（2）饱和酚液：重蒸苯酚用SDS溶液饱和。,5,主要试剂,（3）氯仿-异戊醇液：241（V/V）。,氯仿,异戊醇液,6,主要试剂：,（4）含2乙酸钾的95乙醇溶液。,7,主要试剂：,（5）无水乙醇（6）溶菌酶（B.R.（1mg/L）,8,主要仪器：,（1）台式高速离心机（10000r/min）,9,主要仪器：,（2）Eppendorf管（50mL）,10,主要仪器：,紫外可见分光光度计,11,主要仪器,分析天平,12,主要仪器,真空干燥器,13,主要仪器,电子天平,14,实验步骤：,1粗提取RNA称量干燥的Eppendorf管的质量,取活性干酵母在研钵中研碎，取1g加入Eppendorf管,加10mLSDS-缓冲液使成匀浆。再加溶菌酶1mL，混匀，室温静置10min，再加10ml饱和酚液，室温下剧烈振荡5min，置冰浴中分层。,15,实验步骤：,2分离RNA在04低温环境下，10000r/min离心10min。吸出上层清液，转入新的Eppendorf管。3提纯RNA加同上清液等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min，然后10000r/min离心5min。吸出上层清液，转入另一新Eppendorf管。,16,实验步骤：,4沉淀RNA加2倍体积95乙醇（含2乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA沉淀。再以10000r/min离心5min，弃上清液，,17,实验步骤：,5洗涤RNA沉淀用少许无水乙醇洗一次，迅速离心各1min，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。,18,实验步骤：,6RNA制品纯度的测定及RNA提取率的计算将干燥后RNA产品配制成浓度为1050gml的溶液，在紫外可见分光光度计上测定其260nm处的吸光度，按下式计算RNA制品纯度及RNA提取率,19,实验步骤：,RNA含量=,RNA提取率=,100%,式中，A260为260nm处的吸光度；L为比色杯光径（cm）；0.024为lml溶液含lgRNA的吸光度,20,注意事项：,1、注意安全，试验要用到的有机试剂有毒性，特别是重蒸酚。2、使用离心机时,对称的两只Eppendorf管的质量一定要相同，以保证重心在轴心上。,21,注意事项：,3、有些Eppendorf管，密封不紧，一定要注意防漏。还有的Eppendorf管底部有裂纹，在离心时要把要把有裂纹的一侧放在内侧，防止Ep