第四章-抗体制药.ppt

第四章抗体制药,目录,第一节概述第二节单克隆抗体及其制备第三节基因工程抗体及其制备第四节多功能抗体及其制备第五节抗体工程第六节抗体诊断试剂第七节抗体治疗药物,第一节概述,一.抗体工程与抗体药物1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、球蛋白，并证明抗体活性主要存在于球蛋白组分。,抗体：是指机体受抗原刺激后产生的能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。,B淋巴细胞与抗体的关系：B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。每一个B淋巴细胞只能产生一种抗体。,20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白，统称为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念。,抗体与细菌、病毒或毒素等抗原结合，通过下列3种或其中一种方式除去有害物质：直接使抗原失去活性；使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏；使抗原表面弱化从而易于受补体破坏。,抗体种类：第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody),整体水平抗体生成技术,细胞工程抗体生成技术,基因工程抗体生成技术,多克隆抗体（抗血清）,单克隆抗体,嵌合抗体、改形抗体,“小型化抗体”（单链抗体）,组合抗体库技术,噬菌体抗体库技术,Ig基因转基因小鼠,抗体真核表达技术,多克隆抗体,通过动物免疫并采集抗血清，在血清中通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。所以常规抗体是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonalantibody），简称多抗。,传统抗血清,抗原,免疫,所有抗体混合,1,2,3,4,脾脏,淋巴結,B細胞,早期采用的抗体药物主要为多克隆抗体，虽然其在治疗多种急性中毒中仍发挥重要的作用，但是多克隆抗体存在非均一性、异质性、不稳定性等缺点。,1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（monoclonalantibodyMcAb）。单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的发展。,单克隆抗体的应用,用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定；用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。作为载体制备导向药物。但是要解决以下两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。,基因工程技术为解决这两个问题提供了可能。已通过基因工程技术，制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗体的鼠源性，相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/3，而且鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等已消失，只保留同抗原特异性结合的活性。,二、抗体药物的特异性,单克隆抗体针对特定的单一抗原表位，具有高度的特异性，这是抗体药物发挥治疗作用的重要基础。对于抗肿瘤抗体药物的研究表明，其特异性主要表现在：1.与相关抗原的特异性结合；2.对肿瘤靶细胞的选择性杀伤；3.在动物体内呈靶向性分布；4.对相关的肿瘤显示更强的疗效。,将单克隆抗体与抗癌药物或毒素结合制成“生物导弹”，注射到癌症患者的血液中，能追踪并附着于癌细胞上，其上结合的抗癌药物或毒素杀伤并破坏癌细胞。这种药物具有高度选择性，对癌细胞杀伤力强，不会损伤正常组织细胞。,三、抗体药物的主要研究方向,1.研究新的分子靶点2.免疫检测技术的研发3.抗体的人源化4.抗体药物分子的小型化5.具有抗体功能的融合蛋白,什么是单克隆抗体,单：克隆：抗体：,单个细胞？,无性繁殖,抗原抗体,特异性结合,第二节单克隆抗体及其制备,单克隆抗体（MonoclonalAntibody，McAb）即单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体。是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。,抗体主要由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞只有合成一种抗体的遗传基因。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞进行细胞分裂增殖，即克隆。如果选出一个合成一种抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞所合成的抗体即为单克隆抗体。,抗体,-a,-b,-c,-d,-a-b-c-d,BALB/c,a,b,b,c,d,传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和,脾脏产生各种B細胞,免疫前要先把抗原作成乳剂,免疫,抗原,采血后可得传统抗血清,已建立之小鼠骨髓癌细胞株,由脾脏收集B細胞,抗原通常有多个抗原決定簇,免疫后的脾脏,约在两月內注射五到八次,AgX,细胞融合,AgX,AgX,ELISA,HAT,PEGCellfusion,Hybridomacells融合瘤细胞,（Subcloning）(确定只有一种细胞),d,d,abcd,abcd,+,+-,X,-d,-c,-b,-a,+,-,-d,分株培养筛选,筛选,单抗,传统抗体(抗血清),试验专一性,对抗原的反应,无法分辨,完全不同,单克隆抗体技术的基本原理,要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但B淋巴细胞不能在体外生长。而骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞融合，得到杂种骨髓瘤细胞。,杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。,一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖,杂种细胞,单克隆抗体设计方案,单克隆抗体制备过程,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,（选择性培养基）,选择性培养基：使亲本细胞不能存活而杂种细胞可存活,诱导其融合的方法有哪些？,一、抗原与动物免疫制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。有的抗原可以用化学合成：地高辛。多数抗原为混合物，须经免疫、筛选、克隆化。免疫动物和骨髓瘤细胞供体来自同一品系动物。,免疫的方法采用体内免疫法和体外免疫法。免疫途径包括皮下注射、腹腔注射、静脉注射。,体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用812周龄雌性鼠。,颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔10个细胞进行初次免疫，间隔13周，再追加免疫12次。,可溶性抗原按每只小鼠10100g抗原与弗氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔24周，再用不加佐剂原抗原追加免疫12次。一般在采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原。刺激B细胞分裂。,脾内免疫法即在麻醉下直接将0.10.2ml抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个，可溶性抗原需10g。,体外免疫法用于不能采用体内免疫的情况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫源性极弱，易引起免疫抑制。优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因素少。,体外免疫法：用48周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.55g/ml,在5%CO237下培养45天,再分离脾细胞,进行细胞融合。,o,二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养1.骨髓瘤细胞的选择应尽可能选择自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段的骨髓瘤细胞作为亲本细胞。细胞必须处于良好的生长状态，对数生长期最好。2.免疫脾细胞悬液的制备取经免疫的小鼠，最后一次免疫第三天摘除眼球放血，将小鼠处死，无菌摘取脾脏，研磨制取脾淋巴细胞悬液，洗涤调整细胞浓度。,3.细胞融合的方法：脾细胞（1108）、骨髓瘤细胞（2107）混合，在聚乙二醇（PEG）介导下融合，2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。PEG相对分子量4000，浓度为50%，二甲基亚砜增加融合率。,细胞融合后可产生多种融合细胞。脾脾、脾瘤、瘤瘤融合细胞。,4.杂交瘤细胞的筛选:利用选择培养基HAT培养。由次黄嘌呤(H)氨基喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。A阻断DNA合成。,脾细胞在一般情况下不能连续培养。骨髓瘤细胞都是HGPRT缺乏株，不能利用H和T合成DNA，而脾细胞中有这种酶，所以只有脾-瘤才能在HAT选择培养基上生长。,HAT培养的过程,三、筛选阳性克隆与克隆化筛选的要求：简便、快速、敏感，在短时间内筛选大量样品。筛选阳性克隆常用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。应根据实验室条件及抗原的情况选择合适的方法。,ELISA,原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。,在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。,ELISA用于破伤风抗体的筛选,ELISA,多头加样枪,克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。这种群体细胞的生物学特性和功能完全相同。常用方法：有限稀释法和软琼脂培养法,克隆化,四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定1.杂交瘤细胞鉴定：染色体分析、抗体稳定性分析、外原因子检查。2.单抗进行Ig的类和亚类鉴定：用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴定。3.亲和力常用方法：相对亲和力测定和亲和常数测定,4.纯度含量测定纯度一般用SDS-PAGE或层析法测定5.活性测定测效价6.识别抗原位点测定7.特异性、交叉反应性测定,五、单克隆抗体的大量制备目前制备的方法主要有两种：动物体内诱生法和体外培养法。体外培养法可获10g/ml的抗体。1.体内诱生法可获的520mg/ml抗体，用BALB/c小鼠。降植烷接种杂交瘤细胞取腹水离心上清。,2.体外培养法工业化生产常用方法动物细胞培养技术发展非常迅速，越来越多用于单克隆抗体的生产。生产工艺易控制，对于保证产品的品质很重要。目前常用的方式有两种：悬浮培养和细胞固定化培养。,六、单克隆抗体的纯化依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。体内诱生法单克隆抗体的纯化方法：1.离心:取上清，超滤，盐析。2.分离:凝胶过滤用于IgG、IgM单抗纯化。阴离子交换层析IgG单抗纯化。亲和层析IgG单抗纯化。,优点：在体外“永久”地存活并传代；用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体；适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法；可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。,七、单克隆抗体的优点与局限性,局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围；反应强度不如多克隆抗体；制备技术复杂、费时费工、价格较高。,第三节基因工程抗体及其制备,杂交瘤单抗为鼠源性，应用于人体可产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。目的：降低免疫源性；降低相对分子量。,基因工程抗体：采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体等。,基因工程抗体的优点：最大成度降低抗体的鼠源性，降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；分子较小，穿透力强，更易到达病灶的核心部位；可以根据治疗的需要，制备多种用途的新型抗体；可以采用原核细胞、真核细胞或动植物等多种表达系统大量生产，大大降低成本。,一、人鼠嵌合抗体,抗原抗体结合功能决定于抗体可变区（V），同种性免疫源性决定于抗体稳定区（C）。在基因水平上将鼠源单抗的H和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H和L链基因，与表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)构建表达载体，再共转染骨髓瘤细胞（或CHO细胞），就能表达完整人-鼠嵌合抗体。,嵌合抗体,人-鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。,Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL,免疫球蛋白基因载体的构建,H链嵌合载体,L链嵌合载体,共转染细胞,启动子,人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略,鼠VH,鼠VL,人CL,人CH,抗体分泌细胞,人-鼠嵌合基因工程抗体,二、改形抗体（CDR移植抗体）,尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。CDR移植：把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改形抗体，也就是人源化抗体。,Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。利用基因工程技术，用鼠源性单抗的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性，同时又可消除免疫源性。制备成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。,CDR序列,CDR序列,鼠单克隆抗体,人抗体,人源化抗体（改形抗体）,图4鼠单克隆V区人源化（CDR移植）,经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变。构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。,三、小分子抗体-Fab,Fv,基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗的V区片段，相对分子量为原抗体的1/801/3。即保留CDR区，而Ig分子中的C区不表达。小分子抗体类型有：Fab片段抗体Fv抗体单链抗体单域抗体最小识别单位,小分子抗体的优点：可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性。分子小，穿透力强，易渗透肿瘤组织中，增加药物治疗浓度。免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应。在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出。易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。,Fv,ScFv,单区抗体,最小识别单位,Fab,由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入周质腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。,(1)Fab,免疫球蛋白基因载体的构建,H链表达载体,L链表达载体,共转染细胞,PrVHCH1PrVLCL,图5Fab抗体分子的制备,抗体分泌细胞,VH,VL,CL,-S-S-,CH1,图5Fab抗体分子的制备,Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。,(2)Fv或ScFv,Fv,ScFv,连接肽,Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGS)3。,单链抗体大多在大肠杆菌中表达，有三种形式：直接在细胞质中表达；与其它菌体融合表达融合蛋白；分泌表达具有功能的单链抗体。,约为完整分子的1/12。它只由一个结构域（VH或VL）构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。,四、单域抗体,VH,五、分子识别单位,第四节多功能抗体及其制备,一、双功能抗体二、多功能抗体三、抗体融合蛋白,双链抗体（Diabody）一词最早由Hollinger等于1993年创造。是一种小分子的双价双特异性抗体片段。,一、双功能抗体,双特异性抗体(bispecificantibody,BSAb)是指能同时识别2种抗原的抗体。一种为对应肿瘤相关抗原。另一种为对应效应成分。既能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞，将效应细胞富集在肿瘤周围，而且可以模拟天然配体的作用，与细胞表面引发分子结合，激活效应细胞，实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。,双功能抗体就是双特性抗体。它是一种非天然性抗体。其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。构建方法：化学交联法生物学方法（杂种-杂交瘤）基因工程法,Hollinger等将抗原抗体的轻链可变区基因(VLA)与抗抗原抗体的重链可变区(VHB)通过短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接，将两组嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中，构建成双链抗体的表达质粒。表达后,VLAVHB与VHAVLB交叉连结，形成双特异性抗体。,双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用。,scFv的多聚体,二、多功能抗体,三、抗体融合蛋白,抗体融合蛋白广义属双功能抗体。类型：配基-配基型融合蛋白；配基-Ig型嵌合蛋白；配基-Fv型融合蛋白；受体-Fv型融合蛋白；酶-抗体型融合蛋白；,第五节抗体工程,抗体研究进展3个阶段：1890年白喉抗毒素，多克隆抗体；1975年杂交瘤技术单克隆抗体；1994年基因工程抗体；,抗体库技术产生的三项技术基础,抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。RT-PCR：能克隆全套抗体可变区基因；抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达；噬菌体展示技术（phagedisplay)。,初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。,是在PCR技术和噬菌体展示技术的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P或P相连，在噬菌体表面的一端或者分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。,噬菌体抗体库技术,接头DNA,VHVL,图2噬菌体表面呈现的小分子抗体,基因III或基因VIII,外壳蛋白,VH,VL,1990年McCafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。,噬菌体表面展示系统,一、噬菌体抗体库技术的基本方法,获取目的基因抗体库技术的载体淘筛表达与鉴定,噬菌体表面展示文库技术的要点:,外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端,将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8的先导系列的紧靠下游,随机克隆入相应载体形成组合文库,从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段,用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。,使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。,筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，,噬菌体cDNA展示技术的应用,用于模拟表位的研究。用于DNA、RNA结合蛋白的研究。用于蛋白-蛋白相互作用的研究。用于非蛋白小分子与蛋白相互作用的研究。细胞与蛋白相互作用的研究。酶作用底物的分析、先导化合物的发现、定位信号转导途径等。,二、噬菌体抗体库技术的特点,模拟天然全套抗体库避开了人工免疫和杂交瘤技术可获得高亲和力的人源化抗体,该项技术的优点:将抗体的基因型和表型紧密联系起来;可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术;抗体基因筛选的范围广;技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产;适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、