16S鉴定细菌的种属.ppt

1,利用16SrDNA进行细菌的鉴定,.,2,目录,02,03,文本目录,文本目录,16Sr的定义及其应用于细菌鉴定的原因,04,01,鉴定存在的不足及其解决办法,鉴定的一般步骤,16SrDNA在细菌鉴定中的应用,3,.16SrDNA的定义,16SrRNA为原核生物核糖体RNA的一个亚基，16SrDNA就是编码该亚基的基因。,.用16SrDNA进行细菌鉴定的原因,在原核生物中普遍存在。的相对分子量大小适中，约，便于序列分析。在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。,4,鉴定的一般步骤,细菌基因组的提取,测序获得序列,验证产物扩增是否成功,特异引物扩增序列,与数据库中已知细菌比较获得样品种属信息,选取近似菌种序列构建系统发育树,5,1.弃尽培养液，向培养皿中加入650l的SolutionA，室温静置1分钟。2.用移液枪的取650l的细胞悬浮液转移至CollectionTube中。3.加入0.8l的RNaseA1，激烈振荡15秒钟，然后室温静置1分钟。4.弃去上层有机相，再加入1ml的4预冷的SolutionC充分混匀后12,000rpm离心2分钟5.弃去上层有机相，然后将水相溶液转移至置于CollectionTube上的FilterCup中6.弃FilterCup，在滤液中加入400l的DBBuffer，混合均匀。7.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。将上述操作6混合溶液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。8.将500l的RinseA加入至SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。9.将700l的RinseB加入至SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。10.重复操作步骤9。11.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入50200l的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。12.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。,6,特异引物扩增DNA序列：这个过程一般先用PrimerPremier来设计引物，接下来在利用PCR进行特征序列的扩增。如果是乳酸菌可以用通用引物27f：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1495r：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3。以下是我已EnterococcusKLDS6.0610的16SrDNA为例设计的引物,7,判断16Sr序列扩增是否成功：经琼脂糖凝胶电泳在附近出现条带，说明16srDNA已经扩增成功.由于16srDNA序列长度一般1500bp左右。,8,测序获得序列：这步一般由测序公司来完成。以下是处理后得到的结果,GCATGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCTGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGACAGAGATGG,9,与数据库中已知细菌比较获得样品种属的信息：将测序回来的结果处理后，导入NCBI进行BLAST比对，找到同源性比较高的细菌。,10,1.选取序列时候要选模式菌株（）16SrDNA序列，将下载序列导入到MEGA，构建系统发育树，确定种属信息。2.在导入序列时候应注意是正向匹配还是反向匹配，正向匹配之间导入序列即可，反向时候还得将序列倒置。,11,12,13,上面的序列在构建进化树时就需要倒置，大家可以上下面的网站，进入之后选SMS2，进行序列转换,14,接下来把这些序列导入到MEGA5.2，以下是导入后的结果,15,16,16SrDNA进行细菌鉴定的不足,有的菌种由于种间差异小，单独依靠16SrDNA鉴定不能鉴定到种。,17,解决办法：,1.针对16SrDNA存在的不足，要想对细菌鉴别到种一般需要生化试验加以补充。生化试验包括葡萄糖发酵产酸试验、明胶液化试验、硫化氢试验、吲哚试验、七叶苷水解试验、硝酸盐还原试验等。生化试验结果参照伯杰氏系统细菌学手册，从而使对细菌达到种的鉴定。传统生化实验需要时间较长工作量较大，现已有API、ATB、MID等鉴定系统，由于同时进行多种生化实验，从而能达到对细菌进行快速的鉴定2.利用16S-23SrDNA间隔（IGS）序列同源性分析，IGS序列是一段较低保守的基因间区，相较于16SrDNA结构基因序列，IGS间隔序列体现出了更大的差异性。,18,19,根据API生化实验结果，在参照API生化鉴定手册或者是API电脑分析软件，