SSR分析程序—非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

SSR分析程序非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1 准备DNA样品，将浓度调整至40-60ng/L;2 PCR扩增体系(反应体系总体积：10L) 试 剂 L/tube 终含量 ddH2O 5.15 10 x PCR buffer 1 1x MgCl(25mM) 0.8 2mM dNTP(8mM/4个) 1 0.2mM/个 Primers(5M/2个) 1 250nM/个 Taq 酶(5U/L) 0.05 0.25U/10L 模板DNA 1 40-100ng/10L (注：SSR的引物包括两个：Forward Primer 和 Reverse Primer)最后每个反应管中加30L矿物油；此外，操作时，试剂等应放在冰上；3.PCR扩增 根据引物所要求的结合温度(TM=47、50、55、60)选择扩增程序；PCR反应一般需要3hr左右; SSR分析中所应用的PCR反应程序(引物结合温度 60)File 15 Time-delay 95, 2min 16 Step-cycle 5 cycle(94, 1min; 60, 1.5min; 72, 1min) 17 Step-cycle 30 cycle(92, 30sec; 60, 50sec; 72, 30sec)18 Time-delay 72, 5min19 Time-delay 25, 1min14 Soak-file 4, 24hrsSSR分析中所应用的PCR反应程序(引物结合温度 55)File 21 Time-delay 95, 2min 22 Step-cycle 5 cycle(94, 1min; 55, 1.5min; 72, 1min) 23 Step-cycle 30 cycle(92, 30sec; 55, 50sec; 72, 30sec)24 Time-delay 72, 5min25 Time-delay 25, 1min14 Soak-file 4, 24hrs SSR分析中所应用的PCR反应程序(引物结合温度 50)File 26 Time-delay 95, 2min 27 Step-cycle 5 cycle(94, 1min; 50, 1.5min; 72, 1min) 28 Step-cycle 30 cycle(92, 30sec; 50, 50sec; 72, 30sec)29 Time-delay 72, 5min30 Time-delay 25, 1min14 Soak-file 4, 24hrs4聚丙烯酰胺凝胶制备 4.1 清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干(制胶用玻璃板为硫化玻璃，灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、量筒和玻璃板如果有水，由于胶与水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻璃板上)； 4.2将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物（瓶盖等）上，给玻璃板滴少量100%乙醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干； 4.3 平口玻璃板和凹口玻璃板的三个边均匀的涂抹适量凡士林（凡士林太多不容易清洗）；放上需要厚度的板条，此步应注意密封好板条的相接处，用手将三边和接茬处按牢固，否则容易漏胶；然后用夹子（夹子夹在板条中间）将玻璃板固定于灌胶架上； 4.4 配胶（8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis=37.5:1）、灌胶; 将以下母液按量混合均匀保存于4，一般一周内用完，溶 液 120ml 240ml 40%Acr 24ml 48ml 2%Bis 12.84ml 25.68ml 10XTBE(8.3) 12ml 24ml ddH2O 70.8ml 141.6ml 针对所选用的胶的大小和厚度量取适量以上混合液倒入干净烧杯，加入适量10%APS（催化剂）和TEMED（加速剂），摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固；（注：1 聚丙烯酰胺凝胶在凝固以前有毒，凝固后无毒，因此操作时应戴上手套； 2 板条和梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生胶膜，影响点样和最后电泳质量）对于20cm x 17cm的玻璃板，除去板条尺寸，胶为16.5cm(宽) x 15.5cm(高) x 1mm(厚)，配制如下： 胶混合液 10%APS TEMED 一板胶 30ml 180L 80L 两板胶 60ml 360L 160L 5电泳 5.1 在气门芯中放入金属线，弯成凹形，挂在电泳槽上，在气门芯上均匀涂抹适量凡士林，用来防止上槽缓冲液渗入下槽，往上下电泳槽先加入适量1 x TBE 电泳缓冲液，缓冲液可重复使用6-7次； 5.2 胶凝固后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），取出胶底端的板条，用纸擦净板条上的凡士林，并用板条刮净玻璃板底端内侧的凡士林（防止将玻璃板放入胶槽中的缓冲液时产生气泡），并用水稍微冲洗点样孔处，斜着将玻璃板放入电泳槽，避免胶底端与缓冲液相接处产生气泡，用夹子从上端将玻璃板固定于电泳槽上，再加入缓冲液，使上槽缓冲液至少盖住点样孔，下槽缓冲液至少与胶下边缘相平齐，然后用电泳缓冲液冲洗点样孔； 5.3 向10LPCR扩增样品中加入2L的5x Loading dye（ 此步一般可在PCR扩增完成后进行，从而使溶液充分混合），每个样品点10-12L；最后点Marker DNA; 5.4 恒压或恒流电泳，恒流，1板，50mA-60mA, 电压约300V; 2板，100-120mA, 电压约300-400V；但是应保持电压恒定，否则条带容易弯曲； 注：PCR扩增产物也可以进行琼脂糖凝胶（3%）电泳，用EB染色观察。6银染显色 6.1 当第一染料接近胶底边缘，电泳结束，也可使第一染料跑出；关闭电泳仪，移去夹子，取下玻璃板，将胶从玻璃板上小心取下，切去一角或两个角作为记号，以便于辨认，然后开始银染处理，处理均在摇床上进行，具体步骤如下：10%醋酸(Fix/stop solution) 20分钟纯水 15分钟0.2%硝酸银(染液) 30分钟纯水 10-20秒左右显影液(Developer solution, 4-10) 显影适当定影液(3%或10%醋酸，加几滴甘油) 5分钟包胶 注：定影液将胶在10%的醋酸中处理结束，可向醋酸中加入少许甘油(防止胶在干燥过程中发生胶裂)，摇匀，直接用作定影液； 银染中应注意事项： 水的质量对染色效果影响极大，一般用超纯水或双蒸水，如果水含有污染物，胶可能不显影或仅仅显上部条带；而下部空白； 显影液中碳酸钠的纯度也很重要，建议使用无水碳酸钠； 由于温度过高，显影太快，所以为了便于控制显影过程，一般将显影液储存于4，用时取出；显影液在4长期放置容易结晶，一般使用前1-2天配制即可，显影液配制方法如下： 试剂名称 500ml 1000ml 终浓度Na2CO3(无水碳酸钠) 50g 100g 100g/L50mg/ml硫代硫酸钠 80L 160L 160L/L(Sodium thiosulfate) 甲醛(Formaldehyde) 1ml 2ml 2ml/L （注：50mg/ml硫代硫酸钠溶液应于-20保存） 在10%的定影液加入几滴甘油，可以用作最后的显影液； 每一步都应该轻微摇动，一般在摇床上进行； 银染后在无离子水中的冲洗时间要求十分严格，一般在10秒左右，应小于20秒，如果超过20秒，应重新在0.2%的硝酸银重新染30分钟； 0.2%的硝酸银溶液可以重复使用6-7次，每次适当延长银染时间，最后可以在废弃银液中加入NaCl，使银以AgCl2沉淀，过滤或重力沉淀即可以回收银；因为不容易清洗，所以装硝酸银、显影液和固定液及定影液的盆不能混用；电泳结束后，涂抹凡士林的玻璃板、板条用热水浸泡后，用纸擦去凡士林，再清洗时比较容易洗净，或浸泡后用洗洁精清洗即可。7 包胶 将包胶用的玻璃板洗净，玻璃纸提前泡在水中30-60分钟。包胶时，先在玻璃板上铺一张玻璃纸，赶净气泡，四边向下抹平；将胶放在玻璃纸上，再用另一张玻璃纸盖在胶上，赶净气泡，四边向下抹平，将玻璃板放在吸水纸上，在室温（25）或恒温箱中干燥（由于恒温箱透气性差，干燥过程慢），干燥好的胶可以用热钢锯条封四边；照相或干胶扫描。附录：实验试剂的配制1 2X loading dye(用于变性胶；98%甲酰胺，10mM EDTA，0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯青F F)4保存试 剂 名 称英 文50ml 50ml终浓度甲酰胺Formamide49ml98ml98%乙二酸四乙胺酸EDTA0.1461g0.2922g10mM溴酚兰Bromophenal blue0.025g0.05g0.05%二甲苯青F FXylene cyanol FF0.025g0.05g0.05%2 3X loading dye(用于变性胶；95%甲酰胺，10mM NaOH，0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯青F F)4保存试 剂 名 称英 文50ml 50ml终浓度甲酰胺Formamide47.5ml95ml95%氢氧化钠NaOH0.02g0.04g10mM溴酚兰Bromophenal blue0.025g0.05g0.05%二甲苯青F FXylene cyanol FF0.025g0.05g0.05%3 5 X loading dye(用于非变性胶；100mM EDTA(pH=8.0)，10mM Tris-Hcl(pH=7.5)，5%聚蔗糖400，0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯青F F) 4保存试 剂 名 称英 文50ml 50ml终浓度0.5M乙二酸四乙胺酸0.5M EDTA10ml20ml100mM1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐1M Tris-Hcl0.5ml1ml10mM聚蔗糖400Ficoll 4005g2.5g5%溴酚兰Bromophenal blue0.025g0.05g0.05%二甲苯青F FXylene cyanol FF0.025g0.05g0.05%4 40%丙烯酰胺（Acrlamide）4保存 似结晶状固体，比重较轻，溶解时不要加太多水。将80g丙烯酰胺溶解于100ml水中，微热充分溶解后，凉至RT，定容至200ml;5 2% N、N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis- acrlamide or N、N-Methylene Bis- acrlamide）4保存此试剂为细粉末状固体，比重轻，有毒，称量时应戴防毒面具，以免吸入。将2gN、N-亚甲基丙烯酰胺溶解适量蒸馏水中，充分溶解后，定容至100ml;6 10X TBE(pH=8.3) 电泳缓冲母液 RT保存 Tris-base 54.0g硼酸(Boric acid) 27.5gNa2EDTA.2H2O 4.69g 充分溶解，加4M HCL约30滴，定容500ml。dd H2O 440ml7 10% APS(Ammonium persulfate; 过硫酸铵) -20保存 容易溶解，一般每次配制少量即可，RT放置，短期内用完，-20长期保存亦不好。 将0.1g APS倒进1.5ml离心管中，加入1ml 蒸馏水，充分溶解，分装保存于-20或待用；8 10%冰乙酸（Acetic acid）固定液，加少许甘油也可以用做定影液 只用一次 100ml冰乙酸加900ml蒸馏水；9 0.2%硝酸银（Silver nitrate）避光RT保存，可以使用5-6次，每次适当延长时间 2g硝酸银溶解于1000ml蒸馏水中；10显影液（Developer）4保存； 试剂名称 500ml 1000ml 终浓度Na2CO3 50g 100g 100g/L50mg/ml硫代硫酸钠 80L 160L 160L/L(Sodium thiosulfate) 甲醛(Formaldehyde) 1ml 2ml 2ml/L （注：50mg/ml硫代硫酸钠溶液应于-20保存）以下试剂在变性胶时擦玻璃板用： 11 Gel Repel solution(保存于棕色瓶) 将1ml二甲基二氯硅烷（Dimethyl-diclorosilane; (CH3)2SiCl2, 此试剂保