实验：高中生物DNA的粗提取与鉴定

实验：高中生物DNA的粗提取与鉴定,一.DNA的提取原理,DNA的溶解性；DNA在酒精溶液中的溶解性；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,二.DNA的鉴定原理,DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色;甲基绿（绿色）,三.实验案例以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,（1）提取鸡血细胞的细胞核物质,（2）溶解细胞核内的DNA,（3）析出含DNA的粘稠物,（4）滤取含DNA的粘稠物,（5）将DNA的粘稠物再溶解,（6）过滤含有DNA的氯化钠溶液,（7）提取含杂质较少的DNA,（8）DNA的鉴定,一.DNA的提取原理,1.DNA的溶解性,DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,当氯化钠的物质的量浓度为2molL时，DNA的溶解度最大，浓度为014molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出,DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离,2.DNA在酒精溶液中的溶解性,3.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响,大多数蛋白质不能忍受6080C的高温，而DNA在80C以上才会变性,洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响,二.DNA的鉴定原理,DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂,甲基绿（绿色）,三.DNA的粗提取与鉴定的实验设计,（一）实验材料的选取,2.材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料）,1.原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,动物细胞的破碎较易，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水(渗透作用吸水涨破），同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1.动物细胞,植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜.,2.植物细胞,洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等.,讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质.,（三）去除滤液中的杂质,利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离.,利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；,（四）DNA的析出与鉴定,DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95），静置23min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。,1.DNA的析出,2.DNA的鉴定,鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色,案例：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,三.实验案例,鸡血细胞极易吸水胀破,鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得,1.准备鸡血细胞液,过程：取柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。,柠檬酸钠作用:防止血液凝固,讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？,获取血液中的血细胞，以及除去血浆中的蛋白质杂质,2.方法步骤,将制备好的鸡血细胞液5mL10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL，取其滤液。,提取鸡血细胞的细胞核物质,讨论：,（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？,让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至涨破,（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？,用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA,（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？,过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA,溶解细胞核内的DNA,将氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA溶解在溶液中。然后，用放有纱布的漏斗过滤，取其滤液。,加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时氯化钠为0.14molL）,析出含DNA的粘稠物,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出.,滤取含DNA的粘稠物,用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上,将DNA的粘稠物再溶解,取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2molL的溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中.,过滤含有DNA的氯化钠溶液,取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中.,提取含杂质较少的DNA,在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95的溶液50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA,因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论：为什么要加50mL的冷酒精？,取两支20mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0015molL的溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化,DNA的鉴定,整个实验共“两次蒸馏水，四次过滤，两次析出”,6.讨论：,两次蒸馏水,第一次：细胞吸水胀破;第二次：