线粒体分离及功能测定.doc

组织和线粒体裂解液（Tissue and Mitochondrial lysis buffer）： Components Final concentration Tris-HCl 50mM pH7.4 NaCl 150mM EDTA 2mM EGTA 2mM Triton X-100 0.2% NP-40 0.3% PMSF 100uM NaVO3 1mM NaF 250mM Leupeptin 10ug/ml Aprotinin 2ug/ml DTT 1mM组织线粒体的分离1) 小鼠脱臼处死，迅速取出组织，放入用冰预冷的线粒体提取缓冲液中， 2) 充分洗去血水，尽量去除非组织成分， 3) 在小烧杯中加入新鲜的提取缓冲液，用小剪刀将组织剪碎， 4) 4，电动匀浆机，600rpm 上下 3 次， 5) 1000g 4离心 10min，将上清小心倒入新离心管中， 6) 重复上面步骤一次， 7) 10,00Og 4离心 10min,沉淀即为线粒体， 8) 倒掉上清，加入新鲜的提取缓冲液重悬沉淀，10,000g 洗一次， 9) 最后用适量的提取缓冲液小心悬起沉淀，冰上保存备用（不要超过 6hours），10) 定量线粒体蛋白浓度，用于后续分析。分离或培养细胞线粒体的提取(Dounce 匀浆法) 低渗线粒体缓冲液（Hypotonic mitochondrial buffer）:100 ml Components Final concentration Hepes(KOH) 20mM pH7.2 Sucrose 210mM Mannitol 70mM EDTA 1mM EGTA 1mM MgCl2 1.5mM KCl 10mM DTT 1mM （注：用前加入蛋白抑制剂混合物，包括 100uM PMSF 等）收获细胞，PBS 洗一次，转入 1.5ml 管中，加入适量低渗缓冲液，冰上浸泡约 1hour, 并不时混匀。然后用 Dounce 匀浆器手工匀浆，其间用台盼蓝检查细胞活性状况，至细胞破碎 50%左右停止匀浆。3000 rpm（约 1000g）4离心10min,转移上清至新管中，继续 12,000 rpm 离心 15min，沉淀即为细胞线粒体。用提取缓冲液清洗一次，80冻存备用或直接裂解线粒体体外功能分析 （1）线粒体耗氧测定： a) 测定介质（Measuring buffer）：225mM 甘露醇，70mM 蔗糖，1mM EDTA，0.1% BSA，10mM 磷酸钾缓冲液，pH7.4 。 b) 测定步骤： 1) 预热生物测氧仪并调节氧电极至需体积（2ml），测定温度为 25。 2) 在反应槽中加入2ml 纯水，使仪器稳定 810mins， 调节仪器最大相对氧浓度，然后加入少许保险粉，耗尽水溶液中的氧，调节仪器氧零值。 3) 清洗反应槽，然后加入反应介质，开始测定。介质体积反应总体积（2ml）组织线粒体悬浮液体积。 4) 加入提取的线粒体悬液（一般组织线粒体约60ul，终浓度 1mg/ml），记录一段时间基线后加入外源底物琥珀酸（2.5mM） ，出现 IV 态呼吸，记录约两分钟后，加入 ADP（100mM）3ul，出现III 态呼吸，待ADP 完全消耗后线粒体又恢复到 IV态呼吸。 5) 线粒体呼吸控制率（Respiratory Control Rate, RCR）， 即加入 ADP 时（III 态） 的呼吸速率与ADP 耗竭后（IV 态） 的呼吸速率之比，RCR 反映线粒体膜的完整性和氧化磷酸化的偶联程度。 线粒体膜电位和ROS产生的测定： a) 测定介质 （PT-1 buffer）： 250 mM 蔗糖， 10 mM Hepes pH7.4， 0.5mM KH2PO4，2uM 鱼藤酮和 4.2mM 琥珀酸钾。 b) 测定方法：在石英杯中加入 3ml 反应介质，加入线粒体悬液（终浓度0.5mg/ml），然后加入罗丹明 123（终浓度 30nM） ，混匀后，于 25孵育 5min 后，开始实时监测荧光强度变化（激发波长 520nm,发射波长 527nm）。最后在反应体系中加入 mCCCP (终浓度 1uM)，以达到完全解偶联，使线粒体膜电位完全丧失，记录荧光强度的变化。该荧光强度变化反应线粒体膜电位的高低。测定线粒体ROS 产生与测定膜电位的体系基本一致，不同是加入的荧光探针是 CM-H2DCF（终浓度 500nM），混匀后，同样孵育 5min，开始实时检测荧光强度变化（激发波长500nm，发射波长520nm）。 最后在反应体系中加入antimycin A(终浓度50uM)作为最大量 ROS产生的对照。曲线的斜率即代表线粒体 ROS产生的速率。 组织 ATP 水平的测定 按试剂盒说明书进行，具体步骤如下： 1) 取小块组织（约 50100mg）放入玻璃匀浆器中， 加入适当比例的裂解液（lysis buffer），冰浴充分匀浆以确保组织完全裂解； 2) 裂解后，12,000 rpm 4离心 10min，取上清，考蓝定量蛋白浓度，用于后续测定； 3) 取适当量的 ATP 检测试剂，按照 1：100 的比例用 ATP 检测稀释液稀释 ATP检测试剂，配成 ATP 检测工作液，冰浴暂时保存； 4) 加 100ul ATP检测工作液到检测孔中（96 孔板），室温放置 35min，以使本底的 ATP 全部被消耗掉； 5) 在检测孔中加上 10100ul 样