下呼吸道细菌学检验操作规范(讨论稿)

下呼吸道细菌学检验操作规范（讨论稿）,钟桥苏州市立医院本部,前言,口咽部正常菌群常见的肺部感染机制：吸入性：定植菌吸入肺部呼入性：呼吸机、气溶胶等血播性：见于静脉吸毒或血透患者,分析前下呼吸道标本检验,标本采集咳痰诱导痰（高渗盐水诱导3%NaCl20-30ml）,气管和内镜吸出物（气管插管24h，就有定植菌，仅有临床症状时，否则切勿培养气管吸出物）气管镜标本（由肺科医生或受训后医生采集）支气管肺泡灌洗液（BAL）支气管灌洗液，保护性毛刷标本（PSB），支气管穿刺活检标本支气管灌洗液-BAL-PSB-穿刺活检标本,标本运送,无菌杯条码12h内送检超时，苛养菌如肺炎链球菌减少，口咽部正常菌群将过度生长,标本拒收规则,不接受48h内重复送检培养的标本拒收以下标本申请做下呼吸道感染诊断：,24h内采集的痰标本口水诱导痰鼻冲洗液和分泌物或鼻孔拭子,标本延迟2h且未冷藏，应报告中注明标本延误送检，可能对培养结果造成影响,咽部标本厌氧培养标本支气管刷培养，只能用保护性毛刷支气管灌洗液，气道分泌物。,污染痰标本和气管内标本革兰染色拒收条件的评价（痰涂片2040/LP；气管吸出物低倍镜和油镜下都要检测）,不合格标本有：痰标本=10个上皮细胞/低倍视野但如果WBC数是上皮细胞数的10倍，单一形态的细菌量达到3+至4+，可接受标本进行培养成年人支气管吸出物：10SECs/LPF或未见细菌患儿支气管吸出物：未见细菌如WBC4+，并可见纤维细胞，但未见细菌，最好重新涂片做吖啶橙染色，用荧光显微镜观察弹性纤维上是否有细菌，假单胞菌和嗜血杆菌可能会在这类涂片中漏检；还可以见军团菌，此类感染中常缺少白细胞。,门诊接受到大量脓性标本，应立即接种，不必等待涂片结果。拒收培养标本报告方式：“涂片所见：每低倍镜视野含10个扁平上皮细胞，提示标本质量差，不做培养；如果有临床指征请重新采集标本”“涂片检查40个视野，未见细菌，不做培养；如果临床指征请与实验室联系”不能拒收标本送检军团菌培养、抗酸染色痰标本、气管吸出物和来自囊性纤维化患者的痰标本,分析中下呼吸道标本检验,接种II级生物安全柜内进行尽快处理挑取最脓或血色最浅标本支气管镜标本，做细菌定量培养的BAL和或PSB标本切勿离心。涂片，革兰染色,标本接种血平板、巧克力平板和麦康凯（或中国蓝/伊红美兰）以下步骤可选择一项或多项：在接种后的巧克力平板上贴杆菌肽纸片（10IU），用于抑制上呼吸道微生物菌群，提高流血嗜血杆菌检出率用金葡ATCC25923点种接种后的血平板，便于直接观察嗜血杆菌的卫星现象血平板的第二个1/4区贴奥普托辛(OP)纸片，可在原始平板上直接检测抑制肺炎链球菌的生长。不推荐常规使用，如有大量社区感染肺炎患者标本时可考虑使用,培养3537、5%CO2条件培养48h，最好至72h；侵入性方法采集的肺标本，培养延长至4天,直接试验革兰染色注明细胞、细菌量以及评价结果见表3胆汁溶菌试验革兰阳性双球菌,表3痰涂片革兰染色结果解释,培养结果检查观察24h后平板继续培养平板2448h，为检出霉菌、慢生长菌、苛养的革兰阴性杆菌如博德特菌属革兰染色结果解释培养结果炎性细胞和细菌来决定对培养物下一步处理如培养与涂片不符，重新读片按照表4报告鉴定以下有临床意义的可疑致病菌，排除正常菌群,常见呼吸道重要致病菌链球菌苛养革兰阴性菌革兰阴性双球菌革兰阴性杆菌葡萄球菌革兰阳性杆菌,链球菌Beta-溶血、触酶阴性呈链状或成对排列的球菌化脓链球菌（PYR+）任何数量都要报告患儿标本检查有小溶血环并鉴定B群-溶血链球菌，任何数量都要报告优势菌时，有意义数量的Beta-溶血链球菌不要报告小菌落的beta-溶血链球菌或F群链球菌，因为这些菌是上呼吸道正常菌群,链球菌Alpha-溶血链球菌Optochin敏感实验胆汁溶菌实验（联合上述两个实验进行鉴定）药敏实验，贴OP纸片确认纯度以检查药敏结果是否有污染,苛养革兰阴性杆菌流感嗜血杆菌，卫星现象，ALA实验确认鉴定并作beta-内酰胺酶试验。百日咳博德特菌触酶和尿素酶阳性，培养48h出现肉眼可见菌落巴斯德菌吲哚和氧化酶阳性，动物口腔正常菌群侵蚀艾肯菌上呼吸道正常菌群，无需鉴定,革兰阴性双球菌卡他莫拉菌G-双球菌，氧化酶阳性，血平板上可推动，丁酸盐试验阳性淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌？需检验并报告，不需做药敏试验当培养达到有意义数量时，即使不是优势菌，也报告（表4）,在麦康凯或伊红美兰平板生长良好的革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌鉴定和药敏试验对于住院患者，不管是否有其他病原菌，检查有意义数量的铜绿假单胞菌、不动杆菌、博克霍尔德菌和嗜麦芽菌囊性纤维化患者标本有特殊要求,囊性纤维化患者标本操作规范,葡萄球菌痰涂片显示有优势的呈堆球菌并与白细胞相关，没有其他致病菌时，鉴定有意义菌量的金黄色葡萄球菌住院患者，鉴定并作苯唑西林耐药仅当菌量达到90%纯培养时，鉴定凝固酶阴性葡萄球菌，无需鉴定到种水平，无需做药敏,肠球菌不要报告肠球菌，除非达到90%纯培养很多革兰阳性球菌都是呼吸道正常菌群,革兰阳性杆菌排除任何数量来自免疫抑制患者的奴卡菌和马红球菌（粘液样并尿素酶阳性）马、猪等动物致病菌，可条件致病，可以导致免疫抑制患者的肺炎大芽孢革兰阳性菌，则需排除炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌快速尿素酶阳性（假白喉棒状杆菌），或标本来自ICU插管患者时，鉴定大量优势的棒状杆菌其他革兰阳性杆菌不会引起肺炎，无需鉴定,霉菌念珠菌不能引起肺炎，除非肿瘤患者、肺移植患者或新生儿。酵母菌是口腔正常菌群。,如果涂片时见到细菌但培养不生长，扩大培养，可能存在军团菌、百日咳博德特菌和分枝杆菌。,表4下呼吸道培养致病菌报告指南表6常见可疑菌落形态及快速经典方法初步鉴定,分析后下呼吸道标本报告分析后报告结果革兰染色不要报告涂片中所见的少量菌（1/20视野）；如果未分离到涂片中所见细菌，在报告中注明。如果任何平板上都没有细菌生长，报告“无致病菌生长或正常上呼吸道微生物”，注意抗生素抑制生长阳性报告参照表4指南报告结果和药敏；药敏结果依据CLSI结果解释阳性注意假阳性（携带菌）；阴性不能排除感染,局限性常规培养方法不生长假阴性培养可能由正常菌群污染或事先使用了抗生素假阳性结果可能会对培养结果过度解释,参考文献SusanE.Sharp,AnnRobinsonandMichaelSaubolle,etc.2004.CumulativeTechniquesandProceduresinClinicalMicrobiology7B,LowerRespiratoryTractInfections.ASMPressWashington,D.C.Murray,.R.,Bar