酶双水相萃取

,双水相萃取在蛋白质分离纯化中的应用,Contents,1、双水相系统的形成,2、双水相系统的相图,3、蛋白质双水相萃取的原理,4、蛋白质双水相萃取的过程,5.蛋白质双水相萃取的优缺点,1.1、双水相萃取的形成的概述,熵增混合自发,分子间作用力随着Mr的增加,而增大.,聚合物的不相容性含有聚合物分子的溶液发生分相的现象.,形成原因,First,Second,Third,作用力为斥力,作用力为引力,作用力无强烈引力和斥力,形成双水相系统,形成两相，一相为两高聚物，一相为水相,完全互溶，形成均一相,双水相,均一相,两相,1.2、双水相系统中作用力的表现,1.3、几种常见的双水相体系,2、双水相系统相图,双水相区,单相区,临界点(criticalpoint)：当系线长度趋于零时,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如右图C点：,双节线,系线,3、蛋白质双水解萃取的原理,当蛋白质分子进入双水相系统后，由于其表面性质、电荷作用以及各种作用力（疏水键、氢键、离子键等）的存在，使其在两相间按其分配系数进行选择性分配。蛋白质主要分配在上相，菌体碎片在下相或界面上。,3.1、蛋白质双水相萃取体系常用聚合物,无毒原则,聚乙二醇-葡聚糖,聚乙二醇-磷酸盐,3.2、影响蛋白质分配系数的因素,在很大的浓度范围内，被分离蛋白质的分配系数与浓度无关，而与被分离蛋白质的性质及选定的双水相系统的性质有关,两相的组成,温度、pH值等,两相溶液的比例,蛋白质的分子质量、电荷、极性,聚合物的分子质量、浓度、极性及离子的种类、浓度、电荷等,4、蛋白质双水相萃取过程,目的产物的萃取,PEG循环,无机盐的循环,主要有三部分构成：,匀浆液,ATPS,PEG+盐,ATPS,上相（产物）,上相（PEG、杂蛋白）,下相（目的产物）,下相（废物）,+盐,分离器,分离器,PEG循环,1）目的产物的萃取,细胞悬浮液经珠磨机破碎细胞后，与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进入离心机分相。通过选择合适的双水相组成，一般使目标蛋白质分配到上相(PEG相)，而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相(富盐相)。,2）PEG的循环,在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。PEG回收有两种方法：一种即前面所述的加入盐使蛋白质转入富盐相来回收PEG，一种是将PEG通过离子交换树脂，洗脱剂先洗出PEG，再洗出蛋白质。现在常用的方法是将第1步萃取的PEG相或除去部分蛋白质的PEG相循环利用。,3）无机盐的循环,一种方法是将含磷酸钠的盐相冷却到6，使盐结晶析出，然后用离心机分离收集；另一种是用电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。双水相萃取所用的设备一般都是其他两相体系如水-有机溶剂体系所通用的设备，商业化的混合器-沉淀器系统以及离心分离机已成功应用于双水相萃取。用磁性分离等新技术也可提高两相分离。尽管刚开始应用时，大多数双水相萃取是间歇式的，但此技术更适合于错流萃取的连续生产，这样可有效利用空间和时间，尤其是在与其他分离技术如凝胶过滤、膜分离等相结合使用时。,4.1、蛋白质双水相萃取的工艺流程,ChartTitleinhere,2003,2004,2005,2006,30,0,70,120,enzyme,enzyme,enzyme,enzyme,enzyme,Enzymeticreaction,substrate,product,4.2、蛋白质双水相萃取与酶促反应,enzyme,enzyme,enzyme,EnzymeticreactionwithATPS,5.1、蛋白质双水相萃取的优点,可用于蛋白质的精制，经过几次连续的双水相萃取，得到更高纯度的蛋白质。,两相含水量均很高，与蛋白质有很好的相容性，且不易使蛋白质失活。,所需设备简单，且处理容量大，利于大规模生产。,分离纯化后的蛋白质产物纯度很高，有很大使用价值。,5.2、蛋白质双水相萃取的缺点,系统中水的含量高，分离后的蛋白质液浓度低，需要浓缩以提高产物的浓度。,分离后的蛋白质液含有高分子聚合物和盐类，需要将其除去。,缺点,5.3、双水相萃取技术在工业使用上存在的问题和解决方法,存在问题：成相聚合物价格昂贵是阻碍该技术应用于工业生产的主要因素。葡聚糖是医疗上的血浆代用品，价格很高，用粗品代替精制品又会造成