DNA测序技术及其应用.ppt课件

.,DNA测序技术的发展与应用,指导老师：张椿雨,小组成员：胡娜娜，武巧，姚淼，贾明明,.,1,2,3,4,引言,第三代测序技术,测序技术的应用与展望,第一代测序技术,第二代测序技术,5,.,1引言,DNA序列测定的意义DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对DNA一级结构的详细了解。,.,造福人类的HGP,人类基因组计划（HumanGenomeProjectHGP）于1990年正式启动，其主要目标有：识别人类DNA中所有基因（超过10万个）；测定组成人类DNA的30亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。已于2003年完成。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。,.,DNA测序技术的历史与发展,测序技术最早可以追溯到20世纪50年代。早在1945年就已经出现了关于早期测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。此后在三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，包括Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。,.,DNA测序技术的历史与发展,最近，Helicos公司的单分子测序技术、PacificBiosciences公司的单分子实时(SingleMoleculeRealTime,SMRT)测序技术和OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的纳米孔单分子测序技术被认为是第三代测序技术。测序技术正在向着高通量、低成本、长读取长度的方向发展。,.,2.第一代测序技术,.,化学降解法,基本原理：利用特异的选择性试剂，专一性的随机断裂DNA成不同长短的片段。根据试剂的选择性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳上的区带位置，判断DNA片段末端核苷酸的种类，从而测出DNA的序列。,.,技术路线,将双链DNA样品变为单链每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体电泳,读取DNA的核苷酸顺序,.,.,化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研究人员所掌握，因此用得较多。而且化学降解较之链终止法具有一个明显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。但化学降解法操作过程较麻烦，且用到放射性物质，逐渐被简便快速的Sanger法所代替。,.,双脱氧链终止法,又称为Sanger法。原理：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，合成链序列，由此推知待测模板链的序列。,.,双脱氧链末端终止法测序原理示意图,.,.,Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。,.,荧光自动测序技术,荧光自动测序技术基于Sanger原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。目前，应用最广泛的应用生物系统公司(appliedbiosystems，ABI)3730系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。,.,.,3730全自动测序仪,.,杂交测序技术,该方法不同于化学降解法和Sanger法，是利用DNA杂交原理，将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上，把待测的DNA样品片段变性后与其杂交，根据杂交情况排列出样品的序列信息。,.,杂交测序检测速度快，采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二代测序技术的特点。但该方法误差较大，且不能重复测定。通过几十年的逐步改进,第1代测序仪的读长可以超过1000bp,原始数据的准确率可以高达99.999%,测定每千碱基序列的成本是0.5美元,每天的数据通量可以达到600000碱基。,.,第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。,.,2.第二代测序技术,尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。随着人类基因组计划的完成，后基因组时代，即功能基因组时代已向我们走来。第一代测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，这促使了第二代测序，又称下一代测序(nextgenerationsequencing)的诞生。第二代测序技术包括：454测序技术、Solexa测序技术和SOLiD测序技术。,.,过程概述,基因组DNADNA片段（cDNA）构建ssDNA文库测序（聚合酶合成测序，连接酶合成测序）由于所有的克隆都在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行，每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，从而获得测序数据。DNA序列延伸和成像检测不断重复，最后经过计算机分析就可以获得完整的DNA序列信息。,限制性内切酶酶切,片段两端加上不同的接头,固定，并进行PCR扩增,.,2.1454测序技术,原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。,.,原理图：,构建文库,DNA磁珠捕获与PCR扩增,测序,焦磷酸测序,聚合酶,硫化酶,荧光素酶,.,测序数据输出：,.,指示器,相机,PTP盒,.,454测序法的突出优势是较长的读长，目前GSFLX测序系统的序列读长已超过400bp。虽然454平台的测序成本比其他新一代测序平台要高很多，但对于那些需要长读长的应用，如从头测序，它仍是最理想的选择。缺点是无法准确测量同聚物的长度。,小结,.,2.2Solexa测序技术,Illumina公司的新一代测序仪GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研发，利用合成测序(SequencingbySynthesis)的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。,原理：将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flowcell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flowcell上形成了数以亿Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。,.,原理图,构建ssDNA文库,单链DNA与流动槽附着,BridgePCR,DNA簇线性化,测序,.,测序过程：,dNTP的3羟基被化学方法保护,每轮合成反应只能添加一个碱基,.,测序过程：,.,GenomeAnalyzer系统需要的样品量低至100ng，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到250bp，每次运行后可获得超过20GB的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。,小结,.,2.3SOLiD技术,SOLID通过连接反应进行测序。其基本原理是以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括：,文库准备,扩增,微珠与玻片连接,连接测序,与454测序类似,.,SOLiD系统与454测序系统相比，每张玻片能容纳更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。,.,测序过程：,连接酶,八聚核苷酸,模板,通用测序引物n,.,.,超高通量是SOLID系统最突出的特点，目前SOLID3单次运行可产生50GB的序列数据，相当于17倍人类基因组覆盖度。,小结,.,表1三种二代测序技术对比,.,4.第三代DNA测序技术,第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发展和应用,但是由于其测序速度、成本、准确度等关键问题的解决仍存在困难,研究者们很快将目光转向了更高更新的测序解决方案。单分子测序也就应运而生。,2009年12月,中科院北京基因组研究所与浪潮成立“中科院北京基因组研究所浪潮基因组科学联合实验室”,.,三代测序技术是以单分子测序为特点的测序技术单分子即时DNA测序技术(SMRT)HeliScope单分子测序基于荧光共振能量转移的即时DNA测序纳米孔单分子测序技术,.,第三代测序技术1、目前一期的读取速度为3bp/s2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。3、它的精度非常高，达到99.9999%。,标记荧光基因,DNA聚合酶作用,显微镜下进行荧光探测,零级波导的纳米结构来实现即时观察和背景荧光干扰,4.1单分子即时DNA测序技术,零级波导的纳米结构,小孔的尺寸低于光的波长，小孔底部形成消逝波，创造很小体积的检测空间DNA链周围游离的荧光标记dNTP有限，非常快速进出于小孔，稳定的背景荧光信号荧光标记dNTP被掺入到DNA合成链，其携带的特定荧光会持续一小段时间(荧光光曝),DNA聚合酶,4.2HeliScope单分子测序,优点：采用了一种新的荧光类似物和更加灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了第二代测序必须用PCR扩增出数千个拷贝以增加信号亮度的缺陷。,DNA聚合酶,荧光标记的dNTP,产生荧光CCD记录,发生了碱基延伸反应,平面基板模拟图,4.3基于荧光共振能量转移的即时DNA测序,荧光供体DNA聚合酶荧光受体4种dNTP荧光共振能量转移具体过程优点：游离的dNTP不发光，只有其掺入到新合成的DNA链时才会发光，极大地降低了背景荧光干扰此方法不需要用到持续的高能量的激发光照射，因此也能够极大地减少DNA聚合酶的光损伤作用，进一步延长了测序长度。,能量,DNA分子以一次一个碱基的速度依次通过纳米小孔,利用核酸外切酶的特性来识别出不同的DNA碱基优点：纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。,4.4纳米孔单分子测序技术,内部：核酸外切酶和环式糊精,由生物分子组成的纳米孔,优点：,直接测RNA序列。既然DNA聚合酶能够即时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以应用于第三代测序平台。直接测甲基化的DNA序列。SMRT技术也可利用甲基化碱基特有的荧光信号来识别模板DNA中的甲基化修饰，如N6甲基腺苷、5甲基胞嘧啶或5一羟甲基胞嘧啶,.,表2各种测序技术比较,.,5.基因测序的应用,未知基因组的测序全基因组重测序深度扩增子测序转录组测序关联突变的检测病毒抗药性和传染病源快速检测疾病相关区域、目标区域测定环境基因组学和微生物多样性DNA甲基化模式研究全基因组小分子RNA（miRNA)分析染色质免疫沉淀表观遗传学考古学,.,全基因组重测序,全基因组重测序是对已有参考序列（ReferenceSequence）的物种的不同个体进行基因组测序，并以此为基础进行个体或群体水平的差异性分析。通过全基因组重测序，研究者可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP）、拷贝数变异（CopyNumberVariation，CNV）、插入缺失（InDel，Insertion/Deletion）、结构变异（StructureVariation，SV）等变异位点。这在人类疾病及动植物育种研究等方面具有重大的指导意义。,.,全基因组重测序,完成全基因组测序的部分的物种,.,全基因组重测序,.,全基因组重测序,.,转录组测序（Transcriptomesequencing）,转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。转录组测序是指用新一代高通量测序技术对物种或者组织的转录本进行测序并得到相关的转录本信息。,.,转录组测序（Transcriptomesequencing）,.,新型病源体的快速鉴定,.,艾滋病毒抗药性HIVsequencing,.,外显子&目标区域测序,外显子&目标区域测序是指利用特制的探针对客户感兴趣的蛋白编码区域DNA或某段特定序列进行捕获，富集后进行高通量测序的基因组分析方法。该方法能够获得指定外显子&目标区域的遗传信息，极大的提高了基因组中外显子区域的研究效率，显著降低了研究成本。主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区域内的结构变异。结合大量的公共数据库提供的外显子数据，有利于更好地解释所得变异结构之间的关联和致病机理。,.,目标外显子组测序vs全基因组测序,.,目标外显子测序应用,利用NGSeqCap+GS测序检测白血病突变,.,基因测序的展望,利用光学成像技术设计的新型DNA测序简图,.,光影成像