应用微生物学2

第三章生产有机酸和醇类的微生物,微生物学家早就预言：对每一种天然有机化合物，总存在一种微生物能合成和分解它。就有机酸和醇类大家知道得不少，但从微生物发酵的角度或者说有哪些微生物能产生，哪种微生物最适合用于生产，哪些微生物有潜力，可能就不一定了解的全面。,只知道哪类微生物能产生哪些产品还不够，还应知道怎样从自然界获得它，这才能深入研究它，利用它。另外作为一种微生物产物，必要的性质和用途也要了解，不然研究的目的和方法也就难以清晰。以上问题大家在化学中有所了解，由于时间关系在这里就不一一赘述，必要时可参阅有关专著。,有机酸(organicacid)在化学上是羧酸RCOOH、磺酸RSO2OH、亚磺酸RSOOH、硫羧酸RCOSH等的总称。通常，一般有机酸就指羧酸，我们所讲的有机酸也指羧酸。采用微生物发酵方法生产的有机酸很多是食品酸性添加剂或者本身就是一种食品，如醋。有时也用一些有机酸来抑制食物上微生物引起的腐败作用。能完全抑制一些常见微生物生长的有机酸浓度见表。,对常见细菌完全抑制的某些有机酸浓度单位：mg/100ml菌名乙酸乳酸柠檬酸苹果酸酒石酸琥珀酸大肠杆菌421091466968226鼠伤寒沙门氏菌42921809256226枯草芽孢杆菌8451799246100表皮微球菌4280535346100黄微球菌7480535346100藤黄微球菌428079535668金黄色葡萄球菌255921469268226,第一节乙酸,一、用途乙酸在有机化学工业中的地位与无机化学工业中的硫酸一样，是一种极为重要的化工产品，它的动态常常会反映出整个有机化学工业的面貌。然而，各国对乙酸使用情况则有较大的差异。例如，美国用于生产乙酸乙烯酯的比例较大，而日本则有较多的乙酸用于发酵工业，利用微生物使乙酸转化为某些氨基酸。,乙酸还用做生产食品添加剂谷氨酸、柠檬酸和赖氨酸的基本原料，在这方面乙酸常能与其他廉价的碳水化合物竞争。食品中禁用合成乙酸。（一）乙酸在有机化学工业中的用途1、乙酸乙烯酯几乎所有的乙酸乙烯酯单体都用于生产聚合物，如生产聚乙酸乙烯乳胶、聚乙烯醇及其乙酰化的衍生物、聚乙烯基缩醛和聚乙烯基缩丁醛。少量的乙酸乙烯酯用于生产聚丙烯系纤维、热熔性胶粘剂、与乙烯共聚物、口香糖乳胶体以及其他许多日用化工产品。还用于生产维尼纶合成纤维。,乙酸纤维长期以来是重要的合成聚合物，是重要的热塑性塑料和纤维成分，用于生产塑料板、薄膜和喷漆。乙酸纤维有高度的结晶性，强度好，质地轻，主要用于降落伞、雷达天线罩、工作服、气球、织品材料等。2、溶剂在许多工业有机化学反应中，要用乙酸作为溶剂。例如，对二甲苯液相氧化生产对苯二甲酸的反应介质就是乙酸，在反应中部分乙酸被消耗了，部分则由于回收处理和机械渗漏而流失。由于对苯二甲酸产量大，所以消耗的乙酸也很可观。据估计用于溶剂的乙酸会有所增长。（对苯二甲酸是生产聚酯切片、长短绦纶纤维等化纤产品和其它重要化工产品的原料）。,3、乙酸酯的合成乙酸的低级烷基酯，如甲酯、乙酯、异丙酯、丁酯、叔丁酯、异丁酯和戊酯都是很好的廉价溶剂，其中以乙酯和戊酯最为重要。目前大部分的乙酸酯仍是由乙酸与相应的醇直接酯化合成的。乙酸乙酯除用做溶剂外，也是广泛用于有机合成的乙酰乙酸乙酯（用于有机合成、香料、染料及医药工业）的原料。,4、乙酸盐乙酸能形成各种盐类，如碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、贵金属盐和过渡金属盐，在工业上都有重要的用途，尤其是钠盐和铵盐。5、杀菌剂乙酸和乙酸钠常用于控制面包生产中由真菌引起的发粘现象。最近还用于含水量较高的谷物的保藏。,乙酸和丙酸的混合物对红曲霉、青霉菌和曲霉菌等有杀菌作用。含水量高达27的谷物用乙酸和丙酸的混合物处理，可保存145天而不受霉菌感染，否则谷物在1周内就会变质。6、合成卤代乙酸乙酸的卤代反应可制得氟、氯、溴、碘四种不同取代基的卤代乙酸，其中用途最广的是氯乙酸（应用于农药、医药、染料、日用化工等专业）。乙酸衍生物品种很多，主要包括乙酰乙烯酯、乙酸酐、卤代乙酸、乙酰胺、二甲基乙酰胺、乙酰替苯胺和乙酸酯等。,（二）微生物发酵法生产的乙酸,用微生物生产乙酸的过程是由乙醇或含乙醇的产物如葡萄酒、发酵的苹果汁、麦芽汁和发酵的乳清得到的。它的用途是以乙酸的形式作为生活的必需品。但食醋中并非只含乙酸一种有机酸，酸味是许多有机酸综合平衡的结果。包括：-酮戊二酸、乳酸、琥珀酸、葡萄糖酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸等。,三、产生乙酸的微生物,醋酸菌是指氧化酒精生成乙酸的细菌的总称。它属假单胞杆菌科，是需氧细菌的代表。醋酸菌的主要作用是氧化酒精生成乙酸，某些醋酸菌能继续氧化乙酸分解为二氧化碳和水。醋酸菌的形态为短杆或长杆状细胞，单独、成对或排列成链状，有时几条链平行排列成指级状，细胞大小为13.7mx0.20.5m。,醋酸菌的分类方法有多种，1978年，柳田腾氏根据醋酸菌对维生素要求和对有机酸的同化性，将食醋酿造的优良菌株分为两个属，即醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属。醋酸杆菌属：现已发现有53种，它们的特点是：氧化乙醇生成乙酸，不氧化葡萄糖，不需要维生素，能同化主要有机酸(特别是对乳酸、琥珀酸同化力很强)。,葡萄糖杆菌属：现已发现有8个种，它们的特点是：能氧化乙醇生成乙酸，但氧化能力很弱，它们不再分解乙酸为二氧化碳和水，能利用葡萄糖生成葡萄糖酸，需要维生素，对主要有机酸几乎都不能同化。,几种酿造食醋常见醋酸菌：1奥尔兰醋酸杆菌：属葡萄酒醋酸菌属，是法国奥尔兰地区由葡萄酒生产乙酸的主要菌株，它能产生少量的酯，生酸能力较小，最大产酸量为2.9，但有较强的耐酸性。菌体大小为：0.30.4mx1.62.4m。最适生长温度30，最高温度39，最低8。,2、许氏醋酸杆菌：许氏醋酸杆菌为速酿醋酸菌，是德国有名的速酿醋酸菌株，产酸量最高可达11.5，但耐酸能力比较弱，为人工培养醋酸菌.菌体大小为0.30.41.62.4m。最适生长温度2527.5最高37。,3、弯曲醋酸菌：可能是许氏醋酸菌的变种，细胞呈明显的弯曲，性能与许氏醋酸杆菌类似。4、产醋醋酸杆菌产醋醋酸杆菌是德国哈斯雷醋厂使用的菌株，为速酿醋酸菌。此菌能产生大量的乙酸乙酯，给食醋以葡萄酒的芳香。但该菌株产酸量较低，又可将乙酸分解为二氧化碳和水。菌体大小为0.10.2m1.21.4m；最适生长温度33。,5纹膜醋酸杆菌为啤酒醋酸菌。是日本酿醋的主要菌株。此菌培养过程中在液面能形成乳白色、皱折状、有粘性的菌膜，一摇动易破碎，使液体混浊。产酸量最高可达8.75，能耐酒精1415。此菌株能分解乙酸生成二氧化碳和水。其菌体大小为0.40.8x1.02.0m。最适生长温度为30，最高生长温度42，最低温度为45。,6、恶臭醋酸杆菌为啤酒醋酸菌。此菌在液面能形成皱折的皮膜，菌膜沿器壁上升，溶液不混浊。该菌株最高产酸量为79，耐酒精8以下，并能继续分解乙酸生成二氧化碳和水。其最适培养温度2830，最适pH3.56.0。,7、攀膜醋酸杆菌为葡萄酒醋酸菌，是酿造葡萄酒、葡萄醋的有害菌。此菌在液体中能形成特别粘而薄的膜，沿器壁上升，膜下面的液体很混浊，有不良气味产生，不适于酿醋。,8、胶质醋酸菌为葡萄酒醋酸菌，能在酒醪中繁殖，致使酒醪酸败变粘。该菌生酸速度慢，又分解乙酸并能生成大量粘膜，称为“醋母”，使乙酸产生腐败的坏味。此菌在所有的醋厂都为有害菌。优良醋酸菌种应发酵速度快、转酸率高、代谢产物除乙酸外还应有多种有机酸和芳香性酯类等。,我国醋厂，有的使用人工纯培养醋酸菌，菌种主要有两株：一株是：恶臭醋酸杆菌，菌号AS1.41。该菌细胞杆状，常呈链锁状，大小为0.30.4mX12m，无运动性，不产生芽孢。在长期培养、高温培养、含盐过多或营养不足等条件下，细胞有时出现伸长形、线形或棒形，甚至管状膨大等畸形。,在固体培养基上菌落隆起、平滑，呈灰白色。在液体培养基上培养，菌体沿瓶壁上升，在表面生长，呈淡青色的极薄平滑菌膜，液体不很混浊。最适培养温度2830，最适产酸温度2833，最适pH3.56.0，耐酒精8以下，最高产酸量79(乙酸计)。转化蔗糖力很弱，产葡萄糖酸能力也很弱。能氧化乙酸为CO2和H20，也能同化铵盐。,另一株是沪酿1.01。但是，目前我国大多数酿醋厂，仍然利用天然酸菌进行自然发酵，开放式的操作必然会有天然醋酸菌侵入，致使产品质量不够稳定。醋酸菌能耐11.5的食盐，当食盐浓度大于1.5时其生理作用受到抑制，甚至被杀死。,热醋酸梭菌，厌氧发酵，具不同的乙酸代谢途径。可将1mol己糖转化成3mol乙酸而酵母和醋酸菌只能转化成2mol，发酵由糖到乙酸一步完成。但由于乙酸对其生长有抑制作用，故发酵过程中要中和形成的酸，操作条件严格，营养要求高，至今尚未工业化。,乙醇经过醋酸杆菌的作用形成醋。根据现代分类学的观点，醋酸杆菌能在PH4.5时氧化乙醇成乙酸。其中有一群不氧化醋酸盐和乳酸盐成CO2，这就是葡萄糖杆菌。两种工业用醋酸菌特征如下：特征葡萄糖杆菌醋酸杆菌鞭毛极生或无周生或无氧化乙醇成乙酸慢快氧化醋酸盐成CO2+氧化乳酸盐成CO2+氧化葡萄糖成葡萄糖酸盐+不定三羧酸循环+5-酮基葡萄糖酸+不定,在工业上主要使用的是醋酸杆菌的菌株，通过使用强烈氧化乙醇的种可以进行迅速的发酵作用。通过正确控制发酵时间可以排除醋酸盐继续氧化成CO2的过氧化作用。应用于工业上制造乙酸的种必须耐高浓度的乙醇和乙酸，并且其营养要求比较低。醋酸杆菌在缺氧的情况下，对高浓度乙醇或乙酸，或乙醇和乙酸的混合物都是很敏感的。,第二节柠檬酸,柠檬酸(citricacid)，学名2-羥基-丙烷三羧酸或-羥基丙三酸，分子式C6H8O7，相对分子质量192.13。无水柠檬酸是无色半透明全对称晶体。,一、用途,柠檬酸具有溶解度大、酸味好、毒性小、易于吸收和价格低廉等待点，广泛用做食品酸化剂、药物添加剂、化妆品和洗涤用品添加剂。1、食品工业大量用于食品酸化添加剂特别是软饮料和糖果。加入硬糖中能增加酸味，还有助于使蔗糖转化为单糖类，可避免因蔗糖溶解度小而结晶成粒。食品中加入柠檬酸还可控制适当pH。,2、药物柠檬酸可与水中的碳酸盐作用生成二氧化碳(发泡)和柠檬酸盐，有助于药物的有效成分快速溶解，还可增加某些泻药和麻醉药的溶解作用，并可改善口味，檬酸盐还是血液的抗凝剂。柠檬酸用于配制口服药水可控制pH为3.54.5，以促使药物有效成分的稳定性。,3、化妆品含柠檬酸的洗发液能使头发具有光泽且富有弹性、可与铬矾、糊精、甘油和氯化铵等配制成固发液。4、洗涤剂柠檬酸盐有很好的洗涤剂性质，作为添加剂能取代磷酸盐配制易于生物降解的洗涤剂，以避免富磷化污染环境。,5、其他工业用途可做为二氧化硫吸收剂、油井处理剂、纺织助剂、金属清洁剂、烟草添加剂和废水处理剂等。柠檬酸是我国发酵工业的一个大行业，我国也是世界上最大的柠檬酸生产国，出口量历来处于我国生物技术产品的最前列。,我国柠檬酸的产量和出口量年份产量/104t出口量/104t19760.1319800.8419864.619908.8199211.29.8199416.412.5199520.914.4199625.315.2199726.917.8199826.815.6,二、产生的菌类,生产的原料不同所用菌种不同：淀粉质原料：黑曲霉(生产菌为其变种)烃类原料：假丝酵母1965年，上海工业微生物研究所以“沪轻2号”为出发菌，用氮芥诱变筛选出薯干直接深层发酵工业化生产菌种宇佐美曲霉N558,与天津工业微生物研究所、南通发酵厂等合作使之工业化生产，并在全国推广，形成我国独特的薯干直接深层发酵法生产柠檬酸的工业。,1973年，复旦大学等采用浸渍培养基和溴甲酚绿的滤纸培养黑曲霉，并根据变色圈与菌落直径之比，筛选高产菌株。l974年，上海工业微生物研究所采用酸性平板法从土壤中分离柠檬酸产生菌。并经60Co射线诱变，获得我国柠檬酸生产中的第二代菌种黑曲霉D353。1977年筛选获得第三代高浓度薯干直接深层发酵新菌种黑曲霉5061。1979年筛选获得第四代生产菌种黑曲霉3008。1982年推出第五代生产菌种Co827。,目前大多数工厂仍使用此菌种生产，发酵产酸可达14以上，转化率95以上，周期64h，发酵强度可达2.19kg(hm3)。1990年筛选出Co860菌种，发酵产酸达20，转化率95，周期96h。1998年天津工业微生物研究所选获了新菌种-144、-145优良菌种。石油原料柠檬酸发酵的研究以日本、美国的研究报道占多数。以正烷烃为原料，采用解脂假丝酵母发酵，产酸达18.3，转化率155。其缺点是发酵液中异柠檬酸含量较高。,用NTG(亚硝基胍）诱变处理得到变异株，发酵10正烷烃所得的发酵液中，柠檬酸与异柠檬酸的比例为973，柠檬酸的含量为14.5。但以烃类作基质，因其安全性而不宜用做食品或美容品等的添加剂。目前已知很多微生物能产生柠檬酸，特别是霉菌，尤其是黑曲霉，但生产上用的是其变种。一些细菌如石油节杆菌、捧状杆菌；局限青霉的一些种；假丝酵母的一些种可以烃类为原料产柠檬酸。,第三节、乳酸,乳酸(lacticacid)学名2-羥基丙酸，分子式C3H6O3，结构式CH3CHOHCOOH，相对分子量89.04。,一、用途,1、工业原材料乳酸钙和乳酸钠是两种广泛使用的药物。乳酸钙在医药方面用于补充钙质、固齿和助长骨骼的发育。乳酸钠可用于解除因腹泻脱水、糖尿病和胃炎等引起的酸中毒。乳酸本身可用做消毒防腐剂。,工业级乳酸用于鞣革工业做酸化剂；是合成乳酸甲酯、乙酯和丁酯的原料，这些酯是涂料的溶剂；高沸点乳酸酯是合成树脂的增塑剂；乳酸和己二酸的混合酯，是氯乙烯共聚物的增塑剂。,近年来，生物可降解塑料的研制与开发已成为人们日益关注的问题之一，且有一系列的产品问世。从材料的角度出发，生物降解塑料可分为天然和合成高分子两种。前者主要包括纤维、淀粉、甲壳质等，后者主要包括聚乙交酯(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯乙酸酯(PVA)等。,其中生物降解塑料聚乳酸由于具有生理适应性、优良分解性和安全性好等特点，在医用材料方面有广阔的前景。未来，其应用有望在包装领域取得拓展。目前，我国对聚乳酸的研究和开发尚处于实验室研究阶段，也取得了一定的成绩，但由于多种因素的限制，距工业化生产尚有很大的距离。国外多家公司长期致力于这一领域的研究，部分产品已商品化。,2、乳酸发酵食品它的主要特点有：（1）具有酸味，改善风味，提高营养价值等乳酸菌利用可发酵性糖，产生乳酸，乳酸本身酸味柔和，不仅常作为食品的酸味剂，而且还有助消化的作用。,乳酸菌还可同时伴生醋酸、丙酸等有机酸，它们在赋予食品以酸味的同时还可与发酵中产生的醇、醛、酮等物质相互作用，形成多种呈味物质和去脱不良异味，使乳酸发酵食品具有其独特的风味。乳酸菌在代谢过程中产生多种氨基酸和维生素，提高了产品的营养价值。,（2）防止腐败，便于食品保存乳酸是乳酸菌代谢的主要产物，在防止食品腐败变质中有重要作用。特别近年的研究发现，除乳酸外，在乳酸发酵过程中还形成一些抑菌物质，如链球菌肽。,二、分离乳酸菌的材料,乳酸菌是生物圈的一个重要成员，是能产生乳酸的微生物的总称，绝大多数是厌氧菌或兼性厌氧菌，广泛存在于自然界。1、土壤其数量和种类，取决于土壤的类别和环境条件。土壤中的乳酸菌主要来自灌溉的污水，施肥、植物及雨水的夹带，可以认为乳酸菌不是土壤的土著微生物。,2、水乳酸菌主要存在于污水中，数量可达104105个ml。从污水源头可分离出大量同型和异型发酵乳酸菌，异型菌占乳酸菌总数的25左右。在污水中有时还可以分离到来自人和某些动物粪便的双歧杆菌，所以水中一旦检出双歧杆菌表明水源已被粪便污染。3、肥料肥料包括人畜粪便、厩肥和堆肥。肥料中的乳酸菌种类和数量与污水中差不多，主要来源于人畜粪便。,4、植物和青贮饲料生长的植物上存在着一定数量的乳酸菌。从树叶上分离到的乳酸菌，其数量为101000个g，它们占总细菌数的0.011。植物的根际也是乳酸菌存在较多的地方。乳酸菌在植物中的广泛存在，虽然数量少，但也说明了植物是某些乳酸菌的最初来源。青贮饲料发酵的原动力是乳酸菌及一些酵母菌。发酵初期主要是明串珠菌、肠球菌等迅速繁殖，产生一定量的乳酸，使pH下降，为其他乳酸菌和消化球菌创造条件。在中后期的发酵中植物乳杆菌占优势，还有其他一些乳酸菌。,5、果蔬发酵食品蔬菜乳酸发酵是一种传统的发酵食品，许多果蔬原料都可以进行乳酸发酵。但产量最多、发酵过程最清楚的是泡菜、腌菜和橄榄。在发酵物中可分离到多种乳酸菌。,6、酱和酱油发酵中的乳酸菌酱和酱油是我国著名的传统发酵调味品。整个发酵过程由多种微生物参加，乳酸菌参与了后期发酵。嗜盐片球菌能在高于18的食盐中很好繁殖，在2426的食盐含量中也能繁殖和产生乳酸。它们与酵母联合作用，其代谢产物如乳酸乙酯等能赋予酱油特殊香味。嗜盐片球菌在酱坯中的数量可观，酱坯中的乳酸含量达15mgg，酱油质量较好。,7、乳和乳制品鲜牛乳含有多种营养成分，是一种营养比较完全的食品，非常适合微生物生长繁殖。由于环境中的乳酸菌从乳头侵入乳管之故，所以在开始挤出的乳中含有少量的乳酸菌。大多数乳酸菌是在挤奶过程中，通过用具、草、饲料、灰尘、牛体表等途径污染而进入奶中，在条件适宜的情况下便迅速繁殖起来。大多数情况下牛乳中乳酸菌的含量约为l03个/ml。酸奶及其他发酵乳制品：有的产品是利用牛乳中天然存在的乳酸菌进行发酵，有些则需接种乳酸菌。,在酸牛乳制作中常用做发酵剂的乳酸菌有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。粪便中的另一群重要的乳酸菌是双歧杆菌属，它们是肠道中正常菌群的重要成员。它们在维持肠道菌群平衡中起着重要作用，对人体的健康十分有益。双歧杆菌主要存在于人和动物的肠道内，小肠下部数量可达103106个g，粪便中可达1081012个g。双歧杆菌在人的消化道内的种群和数量随人的年龄、营养、健康等的变化而相应演变。,三、产生乳酸的主要菌类,1、米根霉L-乳酸产生菌2、乳杆菌属L-，D-，DL-乳酸产生菌3、德氏乳杆菌D-，DL-乳酸产生菌4、保加利亚乳杆菌D-，DL-乳酸产生5、嗜热乳杆菌L-乳酸产生菌6、干酪乳杆菌L-乳酸产生菌7、植物乳杆菌DL-乳酸产生菌8、链球菌属L-乳酸产生菌9、肠膜明串珠菌D-乳酸产生菌10、有害片球菌DL-乳酸产生菌11、嗜盐片球菌D-乳酸产生菌,四、乳酸发酵的前景,当今世界食品发展的潮流是营养保健食品，即不仅具有一般食品所具有的营养和色、香、味，而且还具有调节人体生理功能作用。乳酸发酵食品属于营养保健食品，发展乳酸发酵食品符合时代的要求，所以，开发乳酸发酵食品的潜力很大。生物降解塑料聚乳酸由于具有人体适应性、优良分解性和安全性好等特点，在医用材料和包装领域方面有广阔的前景，所以乳酸发酵的研究开发前景很宽广。,第四节丙酮酸,丙酮酸(Pyruvicaicd)，学名2-氧代丙酸、乙酰甲酸。分子式C3H4O3，结构式：CH3COCOOH，相对分子质量88.06。,一、用途,1、丙酮酸是合成多种其他产品的前体例如丙酮酸是合成某些氨基酸，如L-色氨酸、L-酪氨酸、L-多巴、L-亮氨酸、L-半胱氨酸的重要前体。丙酮酸还可用于合成维生素B6、B12。2、丙酮酸在工业上的应用在工业上，丙酮酸是制备氢化阿托酸(是布洛芬类包括布洛芬、酮基布洛芬、苯氧苯丙酸等非甾体抗炎药的母核），和合成乙烯系聚合物的原料。丙酮酸及其盐类还可以作为食品添加剂广泛应用于食品和酿酒工业。,3、丙酮酸在医学领域的应用丙酮酸有很强的抗氧化作用，它有利于防止自由基的形成。丙酮酸与乳酸组成抗氧剂，能降低对细胞的伤害。丙酮酸盐已用于太阳灼伤、痤疮等的治疗。在体育运动中，丙酮酸盐有助于恢复运动员所受的微小损伤，提高机体的耐受性。此外，丙酮酸可与乳酸及锂构成人工胰脏，作为体外传感器，测量乳酸和葡萄糖的含量。,4、丙酮酸的最新用途是应用于减肥方面美国匹兹堡大学医学研究中心经过27年的广泛研究和临床试验发现丙酮酸钙有助于提高脂肪降解，降解率可达48，而对体内的蛋白质降解可控制至最小程度。该产品荣获1997年度美国医药发明奖，1998年度又成为全美减肥品销量冠军。,丙酮酸钙具有减肥效果主要是因为丙酮酸有助于防止脂肪过量储存。食物被消化后，进入血液以被吸收，这时身体分泌胰岛素，用来储存碳水化合物。如果分泌太多的胰岛素，血液中过量的葡萄糖转化为脂肪。丙酮酸有助于将血液中过量的葡萄糖吸入细胞，从而保持低浓度的血糖，并减少胰岛素的分泌。胰岛素量下降，转变为脂肪储存的碳水化合物量就会减少。,二、产生丙酮酸的微生物,据文献记载，自20世纪50年代以来，人们开始探索发酵法生产丙酮酸。研究的微生物很广泛包括：酵母菌、担子菌、霉菌、放线菌、细菌等，不再一一详细介绍。,第五节、苹果酸,苹果酸(malicacid)，学名羥基丁二酸，结构式：CH2(COOH)CH(OH)COOH,分子式C4H6O5，相对分子质量134.09。,一、用途,苹果酸的主要用途可以分为食用和非食用两方面。1、食用方面主要用做食品的酸化剂，特别是软饮料和硬糖。由于苹果酸具有很好的酸味，价廉物美。这方面用途正在不断增长。2、非食用方面包括医药、化妆品、洗牙液、螯合剂(金属清洁剂)和缓冲剂；纺织工业用做阻凝剂。还是有机合成原料。,二、用微生物技术生产苹果酸,用微生物技术生产苹果酸有两类方法，一类是发酵法，一类是固定化细胞法。1、微生物发酵法适用于发酵法生产苹果酸的菌种有米曲霉、黄曲霉、寄生曲霉以及短乳杆菌。由于延胡索酸是苹果酸的真正前体，因此在微生物发酵中苹果酸是由延胡索酸经延胡索酸酶(或延胡索酸水化酶)的作用经过三羧酸循环而形成的。,（）采用曲霉经好氧发酵生产苹果酸。这些曲霉菌种从10的糖溶液中形成的苹果酸量如下：由麦芽糖及葡萄糖得4；由果糖、蔗糖、甘油及山梨醇得3.43.6；由半乳糖、淀粉、甘露糖及糖蜜得2.43.1；由木糖约得1.9。Mn2+、Al3+及Cr4+促进苹果酸的形成。发酵初期先达到足够的菌丝量，这时的培养温度为35，然后保持在28直到形成约5的苹果酸。在培养液内加入约6的CaCO3，发酵产生的苹果酸就以钙盐形式沉淀下来。,（）顶青霉生产苹果酸顶青霉由D-木糖除形成D-木质酸以外，还能形成较大量的L-苹果酸。由10g的D-木糖会形成2.1gD-木质酸及520mgL-苹果酸。（）短乳杆菌生产苹果酸短乳杆菌能在2528时，CaCO3存在的条件下，约20h内，由延胡索酸形成高产量的苹果酸钙。（）根霉与酵母混合发酵生产苹果酸先用根霉形成延胡索酸，接着用膜醭毕赤氏酵母转变成L-苹果酸。（）聚乙二醇可促进苹果酸的生成当加入聚乙二醇于发酵基质中，霉菌所形成的延胡索酸的95左右会转变成苹果酸。,2、用固定化微生物细胞生产利用固定化的氨基短杆菌细胞，可从反丁烯二酸生产左旋苹果酸，药用级苹果酸收率约70。在此法中先将氨基短杆菌细胞用聚丙烯酰胺固定。细胞在生理盐水中的悬浮液与丙烯酰胺和适当的交联剂以及聚合促进剂混合，所得凝胶制成直径3mm的颗粒,洗涤后,浸泡在约含0.3牛胆汁的1mol/L反丁烯二酸钠中，溶液保持在37、20h，经此处理的细胞即用做反应柱的填料。加料是1mol/L的反丁烯二酸钠，在37通过反应柱，用通常的方法从流出物中分离苹果酸。,此法在柱式反应器中于37进行，牛胆汁可提高反丁烯二酸盐的活性和抑制生成丁二酸副产物。用100L反应柱，进料流速为200L/h，可以生成理论收率为15.4td的左旋苹果酸，但实际生产中只能达到理论量的70左右。,第六节、衣康酸,衣康酸，又称为甲叉丁二酸、分解头酸，学名亚甲基丁二酸。结构式：CH2CCOOH，分子式C5H6O4，CH2COOH相对分子量130.10。,一、用途,1、是制造多种有机化合物的添加剂和原料衣康酸及其酯类是制造合成树脂、合成纤维、塑料、橡胶、离子交换树脂、表面活性剂、高分子螯合剂等的良好添加剂和单体原料。它作为交联剂和乳化剂，在含量为15时，生产的苯乙烯-二烯共聚物是质轻、易塑、绝缘、防水、抗蚀性能均好的塑料和涂料。用玻璃纤维填充则是一种高强度玻璃钢，可用于制作车、船和飞机的外壳及各种容器,2、粘结剂含衣康酸的丙烯酸胶乳可以作为非织造纤维的粘结剂。含衣康酸单体的聚氯乙烯显示对纸张、赛璐吩和聚对苯二酸乙二醇薄膜的粘着性增强。聚丙烯晴纤维中含少量的衣康酸，就能大大改善其染色性能，使着色加深。在衣康酸-丙烯酸制成的牙科粘合剂中，加入多价金属氧化物(如锌和镁的硅铝酸盐或氧化物)，具有良好的抗压性能和粘结强度，并有很好的生理适应性。,3、是制造宝石的原料衣康酸聚合物有特殊光泽，透明，适合于制造人造宝石和特种透镜，以及防水性能良好的抗化学剂和涂料等。4、可做除垢剂衣康酸和丙烯酸的共聚物是一种高分子螯合剂，用于作为水处理中的除垢剂，对防止碱性钙、镁垢的形成特别有效。加到海水蒸发脱盐体系中，有效成分为0.510mgL时，就能有效抑制水垢在蒸发器表面的形成与附着。它用于锅炉、水冷却器等系统的在线清洗，在设备不停止运行的情况下，就能除去较厚(0.011.7mm)的垢层。,5、可用于水处理在处理水时，无令人不愉快的气味，可以与其他化学处理剂，如碱剂NaOH、KOH、吗啉或环己胺，缓冲剂磷酸盐、三乙醇胺，以及有机酸盐、螯合剂EDTA和杀菌剂次氯酸钠等配合使用，以达到不同的目的。6、是润滑剂的增稠剂由衣康酸与芳香二胺生成的毗咯烷酮衍生物，是润滑剂的增稠剂等。,由于衣康酸的毒性，几乎没有人将它用在制药工业及食品工业中。尽管衣康酸有着很大的潜在应用价值，但它迄今只有少量得到应用。因为顺丁-烯二酸及反丁-烯二酸在很多情况下和衣康酸有其类似的性质而能代替它。衣康酸的最大用途为造纸业。,二、衣康酸的发酵法生产,1、浅盘法：类似于柠檬酸所采用的，用土曲霉孢子接种过的营养液(大部分是糖蜜)在3032下培养，并在表面上良好通风。最初的pH为1.92.3；霉菌的培养约持续12天，直到发酵完成。在过滤后将培养液蒸发到原始体积的1/10。冷却后酸结晶出来并用离心法分离，其产量约为投人糖量的70一75。,2、深层法：在通气的深层培养中，采用加玉米浆的含糖溶液，以土曲霉为菌种，其最适PH为1.82.2。采用衣康酸曲霉为菌种，pH为4.04.4。大部分生产是采用土曲霉；用木材水解液常用衣康酸曲霉。开始的糖浓度为6，但能提高到15。发酵时间持续23天，其糖转化率为6065，产酸浓度68。在一种两级的深层发酵中，在第一级尽量长菌体，然后将菌丝体转入一个新发酵罐中进行生产衣康酸的发酵。,也有人报道过用连续法生产衣康酸，该法以二级发酵进行，转化率为60。用离子交换树脂可很好地将培养液中的衣康酸分离出来。发酵液中有很多其他的物质，例如赤藓糖醇、琥珀酸、酮戊二酸及一些不饱和脂肪酸，都可作为副产品。,三、产生衣康酸的菌种,衣康酸的工业生产菌种主要是属于土曲霉群的土曲霉和属于灰绿曲霉群的衣康酸曲霉。两群都属于半知菌纲，丛梗孢目，丛梗孢科：两者除了都高产衣康酸之外，在其他方面没有多少共同之处。另外，近来日本一些研究者对酵母的衣康酸发酵进行了研究，但还无工业规模生产的报道。,第七节-亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA),-亚麻酸，学名：全顺式-6,9,12-十八碳三烯酸；商品名称有:真菌油脂、三呜养生王、真菌降脂素等。-亚麻酸是多不饱和脂肪酸，具有3个双键，双键的顺式构象使-亚麻酸的碳氢链几乎成一直线。一般表达方式为18:3第一个数字表示碳原子数，冒号后边的数字表示双键的个数；-亚麻酸的分子式为C18H30O2相对分子质量为278.4。EPA表达方式为20:5，DHA为22:6。,一、生理功用,巳发现EPA和DHA在预防和治疗动脉粥样硬化、血栓形成和高血压，气喘、关节炎、周期性偏头痛、牛皮癣、肾炎，乳腺、前列腺和结肠癌等方面有很好的生理功能。所以这两种脂肪酸已被广泛用于营养保健方面，但天然EPA和DHA通常只在海洋动物和海洋浮游植物中含量丰富。目前市场上供应的这类多不饱和脂肪酸的惟一来源是深海鱼及其鱼油。,-亚麻酸(GLA)是人体必需的脂肪酸之一，国外有些报道称为维生素F，由于它在医学方面的重要性，所以除了作为营养保健品之外，当前的发展动向主要朝向医药方面，因此，大量的资料报道了-亚麻酸在代谢调控中的作用，以及对许多疾病调控的机理。-亚麻酸在人体内由亚油酸转化而来，-亚麻酸是人体合成前列腺素的前体，因此-亚麻酸的缺乏会导致人体内分泌代谢机能的显著紊乱。-亚麻酸在医学上的用途表现在以下几个方面：,1、改善心血管障碍包括降低胆固醇水平、降低血压、降低甘油三酯、增强血小板凝集。2、糖尿病综合征3、癌症已经有实验表明-亚麻酸对某些肿瘤细胞有的细胞毒性，主要对腹水瘤、淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、骨肉瘤及食管瘤细胞的生长有明显的抑制作用。4、生殖紊乱包括乳房疼痛和月经前综合征。5、皮肤病湿疹和普通鳞癣病。,6、抗病毒感染能增强内源性防御以抵抗病毒的袭击。7、抗衰老等。-亚麻酸之所以具有重要的生理功能，是因为它是人体内细胞膜的必需组分，并且赋予细胞膜柔韧性、流动性和选择通透性。因此，一旦细胞膜缺乏-亚麻酸等必需脂肪酸，就会丧失了细胞膜固有的特性而引发许多疾病。所以-亚麻酸的生理功能是一种结构功能。,二、产生EPA、DHA和GLA的微生物,能产生一定量EPA的微生物有较低级真菌中的藻状菌纲和藻类。高山被孢霉在12的低温条件下，可积累总脂肪酸量15以上的EPA。一种分离自海岸边水中的金色破囊壶菌，是一种海生真菌，是目前已知的含DHA最高的真菌。,已发现许多海藻能产生较多量的EPA，但淡水藻中几乎不含有值得开发的藻类。用于发酵生产-亚麻酸的微生物主要是一些低等的丝状真菌，大多分布于接合菌纲中，已报道的有：被孢霉属、根霉属、小克银汉霉属、毛霉属、枝霉属等。,第八节、乙醇,乙醇，商品名酒精，分子式C2H6O,结构式CH3CH2OH，相对分子量46.07，是一种具有香味而刺鼻的无色透明液体。,一、用途,乙醇是重要的轻化工原料，也是酒精饮料的基本成分，从长远看又是一种重要的能源。1、溶剂：乙醇是重要的有机溶剂，用在卫生用品和药品、洗涤剂、工业加工溶剂、专用溶剂和稀释剂、表面涂料溶剂等六个方面。,美国，用量最大的是卫生用品，占溶剂总用量的40，其次是专用溶剂，占24洗涤剂占22，工业加工用溶剂占12。西欧则大部分消费在化妆品及卫生用品方面。近年来乙醇用于洗涤剂和液体去垢剂的量增长很快，用于化妆品的量也有相应增长。法国、意大利对合成乙醇在医药和化妆品方面的应用做了限制。,2、基本化工原料：乙醇是重要的基本化工原料，300种以上产品需要乙醇。目前化学用乙醇总量的增长率主要取决于乙酸乙酯和其他乙基酯类及乙二醇酯类的用量。,3、能源多年来，乙醇已在一些国家作为汽车燃料的一种掺和剂。我国非常重视“燃料酒精”的发展，而且前景越来越好。4、勾兑白酒我国的发酵法乙醇则大量用于勾兑白酒，每年用量达200余万吨。5、乙醇还是其他各种酒类的主要成分。,二、微生物发酵法生产乙醇,随着石化工业的迅速发展，合成法乙醇的产量很大，但合成法乙醇中夹杂的异构高碳醇对人的高级神经中枢有麻痹作用，不适宜制作饮料、食品、医药和香料等。因此发酵法乙醇不可能全部被代替，美国始终保持在总产量的10左右，我国则主要为发酵法乙醇。（一）可以采用的原料：,1、含淀粉的原料谷物类：特别是玉米、稻米；薯类：如马铃薯、甘薯和木薯等。这些基质在发酵前必须先经-淀粉酶液化，糖化酶糖化，或边糖化边发酵。2、含糖原料如糖蜜、木糖、乳清等无须预先糖化就可直接接入酒精酵母直接发酵。3、一些含有淀粉或糖类的残渣残液。,（二）生产乙醇的菌类发酵法生产乙醇一般采用酿酒酵母及其亚种、粟酒裂殖酵母、克鲁维酵母、运动发酵单胞菌等，酿酒酵母是主要的。、对菌种的要求原材料不同，对菌种的要求也不同。一般对酵母的要求为：（1）发酵能力高，繁殖速度快：这样能很快达到需要的细胞密度，快速并完全地将糖分转化为乙醇。,（2）要具有高的耐乙醇能力和忍受较高的渗透压：这样就可以采用浓醪发酵产生更高浓度的乙醇。（3）对杂菌抵抗力强，耐温、耐盐、耐有机酸能力强，对培养基的适应性强，发酵稳定。（4）对于采用糖蜜发酵的菌株还应在含高浓度灰分和胶体物质的糖液中正常快速地生长繁殖并进行乙醇发酵。还能有较高的耐酸和耐温的能力。,2、含乙醇酒类对菌种的要求应该特别指出的是上述讲的是指生产乙醇而非生产含乙醇饮料和酒类，发酵生产这些产品的菌种要求是不同的。如啤酒酿造所用的卡尔斯伯酵母的评估与筛选就有自己的标准。内容有：（）细胞的形态：为圆形、卵形或椭圆形。（2）细胞大小：倾向中小型细胞的菌株。（3）繁殖速度：选择繁殖速度快的菌株，15平均世代时间应8小时。（4）细胞密度：6.01078.0107个/ml，密度大的菌株发酵速度快；,（5）同化能力强：对麦汁的-氨基氮同化能力强，同化率为6075。（6）发酵力强：对麦汁中麦芽三糖的发酵率70以上。另外，还应选择凝聚性中等或强；对于粉末型酵母沉淀能力应选择发酵后沉淀结实；双乙酰峰值低和还原速度快的菌株；挥发性风味物质的产生与啤酒风味适应等的菌株。食品中的乙醇发酵不仅仅是产生“酒”，还应伴随着风味物质的合成。啤酒如此，白酒、葡萄酒、黄酒等也应如此。,3、发酵单胞菌的特点：（1）发酵速度快由于单位体积的细胞数较酵母大10倍以上，所以比表面积要大，这样糖的吸收速度要比酵母快12倍，酒精产生速度就快得多。（2）糖转化酒精率高由于代谢途径的差异，糖转化酒精率比酵母高，每消耗1mol葡萄糖可生成1.9mol酒精；正常发酵温度为3637，比酵母高67，有利于高温发酵的进行。但细菌发酵生产还不成熟，还要进行深入研究。,（三）乙醇发酵的工艺技术原料不同，采用的工艺技术也不同。、采用具有糖化和发酵两类酶系统的菌种可以直接采用淀粉质原料和糖类直接发酵；2、采用一般的酒精酵母和细菌，淀粉质原料必须先糖化。所有酒精发酵都应采用厌氧发酵工艺。,第九节、丙三醇,丙三醇(propane-1,2,3-triol)俗称甘油(glycerol)，是一种最简单的三元醇。分子式C3H8O3，结构式CH2CHCH2，相对分子量92.09。OHOHOH,一、用途,丙三醇是广泛用于国民经济各个部门的重要有机化工产品。它具有沸点高、粘度高、吸湿性好、溶解性好等特性，因而成为性能优异的吸湿剂、抗冻剂、润滑剂、溶剂或助剂。丙三醇分子中的三个羥基的多功能作用能与多种物质反应，是醇酸树脂、聚氨基甲酸脂、赛璐玢和炸药的重要原料。,（一）丙三醇的应用：1、食品工业甘油易于消化而无毒，可用做食品工业的溶剂、吸湿剂和载色剂。在调味和着色食品中，由于甘油具有粘性而有助于食品成型。在食品的快速冷冻中，甘油可用做与食品直接接触的传热介质。甘油还是食品加工和包装机械的润滑剂。此外，聚甘油和聚甘油脂在制造松脆食品和人造奶油方面的应用正逐年增加。,2、药物和化妆品甘油在药物和化妆品制造中常用做软化剂、粘度改进剂和溶剂。例如：凝胶和软膏中的淀粉甘油以及麻醉药、止咳药中均有甘油存在。甘油衍生物如甘油创木酚可用做镇静剂，硝化甘油（速效救心丸）是冠状动脉痉挛中的一种血管扩张药等。化妆品中甘油广泛用于雪花膏、洗涤剂和牙膏的配方中。,3、烟草在烟草加工中，喷涂甘油能防止烟叶碎裂，增加烟草的甜味和防止脱水。4、润滑剂甘油比其他矿物油的耐氧化性能更好，所以在特殊场合(例如：氧气压缩机；耐苯耐汽油的轴承等)中用做润滑剂。纺织工业中甘油可用于纺丝、纺纱操作中。5、塑料和涂料工业甘油常用做聚氨酯泡沫塑料生产中的起始剂，也是生产醇酸树脂和赛璐玢的重要原料。6、其他甘油在陶瓷、照相、皮革、木材等工业广泛应用。,（二）工业衍生物的应用：丙三醇的重要工业衍生物有酯、胺、醚、缩醛等。1、酯类甘油酯类的用途最广。工业上重要的酯类有醇酸树酯、硝化甘油、脂肪酸甘油酯等。应用于合成橡胶、涂料、表面活性剂和纺织工业中。甘油与冰醋酸加热而形成甘油乙酸酯(俗称醋精)，是工业重要的溶剂、增塑剂或软化剂。三乙酸甘油酯除少量用做香料固定剂及硝酸纤维、烟草和化妆品的增塑剂外，还是固体火箭燃料粘结剂的组分。,2、醚类甘油醚中以聚甘油最为重要。高分子量的聚甘油为固体物质，可溶于水、醇和其他极性溶剂中。聚甘油可用做表面活性剂、乳化剂、增塑剂、粘合剂、润滑剂等。3、缩醛或缩酮甘油的缩醛或缩酮是具有几何异构和旋光异构的杂环化合物，可用做溶剂和增塑剂。,二、产生丙三醇的菌类,1、耐渗透压酵母依生长环境，耐渗透压酵母分为耐高糖浓度和耐高盐浓度两类。在海洋、干旱环境和高盐食品中广泛存在耐盐酵母；在高糖浓度的食品和花果中含有耐糖酵母。这些酵母在高渗透压下在细胞内能积累丙三醇和其他多元醇(阿拉伯醇、赤藓醇、甘露醇)。,耐渗透压酵母通过EMP和HMP途径生产丙三醇及其他多元醇，其产率受生长条件的影响，如培养基的组成、供氧水平、温度等。耐渗透压酵母与一般酵母生产丙三醇的基本差别为：在需氧而不是微需氧或厌氧下生长；不需要加入转向剂；在较高的糖浓度下生长发酵；得到高的糖转化率(可达到60)及丙三醇产率。,2、藻类藻类生长在高盐浓度的环境中，具有能形成胞内丙三醇作为抵抗高盐浓度环境的生存机制。耐盐绿藻能产生相当于50藻类干重的胞内丙三醇，这样通过大量培养藻类是丙三醇生产的又一途径。藻类培养途径是在高盐环境中利用最经济太阳能、CO2，添加适当浓度的硝酸盐、磷酸盐、微量元素等生长因子，pH79，适宜温度10一40。,在胞内积累丙三醇，副产物可作为动物饲料并且提供胡萝卜素(维生素A的前体)，也没有废水处理问题。藻类对盐的浓度不敏感，但盐的浓度对其的生长有很大的作用。对藻类进行小规模培养以海水和CO2为主要料，阳光为主要的能源、因藻类菌体生长和丙三醇生产所需的最佳NaCl浓度不同，故丙三醇生产分两步：培养阶段和生产阶段,（1）培养阶段：目的是生产有活力高浓度的藻类细胞。在培养阶段先通入海水，在池底连续通入气体CO2，洗涤除去硫化合物和其他有毒物质，再加入KNO3、NH4H2PO4、NaCl，浓度分别为4.0mmol/L、1.0mmolL、0.5molL。NaCl浓度控制在0.5molL，以适合细胞的快速生长和繁殖，最大面积的接触阳光照射。,（2）、丙三醇生产阶段：藻类细胞在培养池中生长好了就经过沉淀、离心，流入渗透罐进行丙三醇的合成。生产阶段的目的是利用含高盐浓度(4.5mol/LNaCl)的培养条件生产胞内丙三醇。在渗透罐内高盐浓度环境激活了藻类细胞的生存机制，首先细胞体积缩小排除部分胞内水分，增加胞内溶质浓度，同时胞内储存的多糖只需较少的太阳能和CO2就转化成丙三醇以应答瞬时渗透压环境的改变。,随后利用太阳能和CO2进一步合成丙三醇以平衡胞外的渗透压环境，最后胞内丙三醇的积累可达细胞干重的50。渗透罐所需体积比培养罐小，没有新细胞的产生，在培养罐中的培养时间为12天，渗透罐丙三醇的合成只需几小时。,第十节、丁醇类,正丁醇(butylalcohol)，学名1-丁醇，分子式:C4H10O，结构式:CH3CH2CH2CH2OH，相对分子质量:74.12,是无色透明具有特殊气味的液体.,一、用途,1、在工业中的应用(1)正丁醇及其衍生物的最大用途是做溶剂和在涂料工业中作为配制硝化纤维素喷漆；(2)丁醇可作为醇酸树脂、合成橡胶、润滑油、有机染料和印刷油墨的溶剂；(3)用做石油炼制工业的脱蜡剂、酒精的变性剂、汽车轮胎刹车油的稀释剂；,(4)可与磷酸化合生成去锈剂；(5)是制造乙酸丁酯、丙酸丁酯、丁酸丁酯和乳酸丁酯的原料。(6)丁酯用做硝化纤维素、醋酸纤维素、纸浆、人造革、织物涂料等的复合溶剂；还是制造对苯二甲酸二丁酯(PBT)、癸二酸二丁酯、柠檬酸三丁酯等聚氯乙烯塑料制品、无毒增塑剂、黄原酸丁杨选矿剂、二丁醚、丁醛、乙二醇单丁,酯、丁酸、橡胶硫化促进剂、二丁基苯胺染料中间体、氯丁烷变性剂和合成辛醇的原料等。2、在医药上的应用在医药上用于制造抗生素、维生素、激素等的抽提剂。,二、产生丁醇类菌的种类和来源,1、种类产生菌是一群严格厌氧的革兰氏阳性梭状芽孢杆菌。按发酵产物分成三个工业类群：丁酸型：丁酸梭菌丙酮丁醇型：丙酮丁醇梭菌丁醇异丙醇型；丁基梭菌这些菌种皆能形成芽孢，应用热处理法分离而易于获得。,2、来源产丁醇类溶剂的菌类分布极广，各种土壤、各类植物种子，都有其栖息，且多呈孢子形态存在。该项菌类主要来源：（1）植物种子如糯米、稻米、高粱、大麦、小麦、豆类等。（2）块根、块茎类如马铃薯、红薯、木薯、藕等。（3）土壤如甘蔗田、红薯田、养鸡场、牧场、屠场、酒场、米场、堆肥场、污地、蔗渣堆等。,（4）其他如甘蔗根、麦粉、米糠、麸皮、花生壳、咖啡、酒曲、酒糟、米糟、堆肥、牛粪、蒸馏废醪、枯草等。大体上，由谷类中分离得到的菌类及蒸馏废醪残留的耐高温芽孢，经过纯化、驯养、选择及培养，发酵结果较土壤或其他样品所分离的菌的效果好。,三、分离丁醇类菌的热处理法,1、样品采集方法（1）预备干热灭菌过的试管(附棉塞)、培养皿(以纸包裹)及三角瓶(附棉塞)。（2）将采集的谷物和土壤分别置于试管或小三角瓶中。（3）块茎类样品置于培养皿内。,（4）采集土壤时，用小铲挖掘离表土1020cm的土层，立即装入试管内。挖土前后小铲均应用7075的酒精消毒。（5）河谷污泥及阴沟残物，可用无菌吸管吸取，置于试管中。,2、采集试样的处理（1）污泥类河谷及阴沟的污泥必须迅速分离，以防菌类变化。（2）块茎类如马铃薯等，先切碎，置于试管中，在室温下加自来水任其腐败(约10天左右)后应用。,3、热处理取配制分装的培养基，加入样品少量(35g)，在70沸水中维持10min加热处理，取出急冷，置于常压或抽气至2.7kPa的真空干燥器中，保持温度37培养23天，选出气泡发生较强，并嗅有丙酮丁醇香气的，置于沸水中，维持34min，以杀灭