第04章药物定量分析与分析方法验证

第四章药物定量分析与分析方法的验证,样品（包括生物样品）的前处理定量分析方法及验证内容,第一节样品的前处理方法哪些药品需要前处理何为不经有机破坏处理何为有机破坏处理生物样品前处理,一、需要前处理的样品含金属药物：富马酸亚铁、葡萄糖酸锑钠、枸橼酸铋钾、葡萄糖酸锌、酒石酸锑钾等。含卤素药物：泛影酸、三氯叔丁醇、碘番酸、磺溴酞钠等。生物样品：血样、尿液、唾液、头发等,含金属或卤素、氮、硫、磷的药物，在分析前需要经过不同方法处理之后，方可进行测定。处理方法因金属或卤素在分子中结合的牢固程度而异。如：有机卤素药物，所含卤素原子均直接与碳原子相连，但不同药物中卤素所处的位置不同，则与碳原子结合的牢固程度就有差异。如果卤素和芳环相连接，则结合牢固，与脂肪链的碳原子相连接，则结合不牢固。,分析含金属或卤素、氮、硫、磷等元素的有机药物之前，需进行适当的样品前处理：1.不经有机破坏的分析方法2.经有机破坏的分析方法,而含金属的有机药物，有两种情况：一是金属原子不直接与碳原子相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物，称为含金属的有机化合物，其分子结构中的金属原子结合不够牢固，在水溶液中既可离解出金属离子，如有机结构部分不干扰分析时，可在溶液中直接进行其金属的鉴别或含量定；二是金属原子直接与碳原子以共价键相连接，结合状态比较牢，称为有机金属药物，在溶液中其金属一般不能解离成离子状态，应该根据共价键的牢固程度，经适当处理，将其金属转变为适于分析的状态，应该根据共价键的牢固程度，经适当处理，将其金属转变为适于分析的状态（多转变为无机的金属盐或离子），方可进行其金属的鉴别或含量测定。,二、不经有机破坏处理的分析方法直接测定法,适用于金属原子不直接与碳原子相连的或某些CM键结合不牢固的有机金属药物,经氧化还原后测定法（Zn）适合于卤素结合于芳环上的药物,经水解后测定法适合于卤素与脂肪碳链相连的药物,适用于金属原子或卤素与碳原子结合牢固的有机金属药物。,湿法破坏干法破坏,三、经有机破坏处理的分析方法,高温炽灼法氧瓶燃烧法,1.湿法破坏：（含氮有机合成药物）（1）硝酸-高氯酸法（2）硝酸-硫酸法（3）硫酸-硫酸盐法（4）其它湿法,注意：湿法破坏的仪器一般为凯氏烧瓶；试剂应不含被测离子或干扰测定的成分；由于矿酸量数倍于样品，须做空白实验校正；操作须在通风橱内进行。,2.高温炽灼法,适用于湿法不易破坏完全的有机物以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。经高温灼烧灰化，使有机结构分解而待测元素转化为无机元素,3.氧瓶燃烧法（Oxygenflaskcombustionmethod）,将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定,适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析,仪器装置,无灰滤纸,透明胶纸,燃烧、催化,称样燃烧分解操作（通O21-2min，燃烧）吸收液水-NaOH（含碘、溴、氯药物）例盐酸胺碘酮、碘苯酯、甲状腺粉水-H2O2（含硫药物）例磺溴酞钠水（含氟药物）硝酸溶液（含硒药物）,第二节定量分析方法,化学分析法光谱分析法色谱分析法,重量分析法容量分析法,紫外分析法UV荧光分析法FIA,高效液相色谱HPLC气相色谱GC,容量分析法（滴定）概念：一定浓度的滴定液由滴定管加到待测药物溶液中，按化学计量反应完全。根据滴定液浓度、体积及化学计量计算被测药物含量。关键问题：等当点的确定。滴定点指示剂显示的滴定终点（指示剂的变色点）等当点反应的化学计量点（消耗的滴定液的摩尔数被测物摩尔数）,特点：操作简便、快速、实验条件易实现，测定结果准确，相对误差小于0.2%，但是专属性差，通常用于高含量和中含量药物，应用于化学原料药的含量测定。滴定方式,直接滴定法剩余滴定法置换滴定法,含量的计算：定量关系：aAbB被测药物滴定液,化学计量关系nA/anB/bWA/aMAWB/bMB,滴定度：1mL某物质的量浓度的滴定液相当于被测药物的重量，中国药典用mg表示。滴定度的计算：,T滴定度(mg/ml)c滴定液浓度(mol/L)M被测物质分子量,以I2（0.05mol/l）计，反应摩尔比11,例,直接滴定法含量100实际工作中配制的滴定液浓度与药典中的规定浓度不一致，须引入滴定液浓度校正因子(f)F含量,基于滴定度的百分含量计算：,回滴定法加入滴定液A与被测药物完全反应，再以滴定液B回滴剩余的滴定液A滴定液A与滴定液B的浓度是相当的，根据消耗回滴的滴定液体积进行计算本法需进行空白试验校正含量100,光谱分析法利用物质的光谱特性进行定量介绍两种光谱分析方法：紫外可见分光光度法,分子的价电子吸收了光的能量，由低能量的基态跃迁到高能量的激发态，在相应波长位置出现吸收带形成的光谱，称为紫外-可见吸收光谱,紫外吸收光谱图,紫外可见分光光度法波长范围200760nm定量分析基本原理：朗伯-比尔定律A=ECL特点：灵敏度高(10-410-7g/mL)；准确度高；仪器便宜；易操作,（一）对溶剂的要求A尽量小,（二）空白对照试验清零,（三）测定波长确证2nm,（四）供试液的浓度A=0.30.7,吸收度的测定要求,含量测定吸收系数法（不需要对照品）测定处吸收度，以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量100,含量测定对照品比较法:配制供试品溶液和对照品溶液，测定处吸收度C待测C对照含量100要求浓度与吸光度成正比，因此供试品与对照品溶液中的被测成分应尽可能一致（实际要求10%）,含量测定标准曲线法（多点对照）绘制对照液浓度吸光度标准曲线（3-5点）拟合回归方程，求出供试液浓度,标准曲线,计算分光光度法多波长校正计算分光光度法,双波长分光光度法三波长分光光度法导数光谱法解联立方程法,比色法：供试品本身在紫外-可见光区没有强吸收，或在紫外光区虽有吸收，但为了避免干扰或提高灵敏度，加入适当的显色剂显色后进行测定。,荧光分析法荧光处于第一激发态的分子，跃迁回基态时发射的光称为荧光，其能量小于激发光，波长长于激发光；除去激发光源，荧光立即熄灭,荧光激发光谱（激发光谱）荧光发射光谱（荧光光谱）,荧光为发射光，利用荧光的物理特性进行定性与定量测定的方法称为荧光分析法,（激发光谱）,（发射光谱）,原理当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件一定时，在较稀浓度范围内药物的荧光强度与溶液中该物质的浓度成正比,荧光强度浓度,特点：灵敏度较紫外高、选择性好(10-1010-12g/mL)；取样少、方法快速；应在低浓度下进行；干扰因素较多，须进行空白校正；能产生荧光的物质较少，可采用荧光衍生化处理,含量测定对照品比较法由于绝对荧光强度难以测定，需要在每次测定前用一定浓度的对照品溶液校正仪器灵敏度，然后读取对照品溶液、供试品溶液及各自溶剂的空白读数。C待测C对照由于浓度线性范围较窄，应在0.52.0之间,色谱分析法是一种分离分析方法利用各组分在固定相和流动相之间分配系数的差异得到分离，再逐个进行分析介绍两种色谱分析方法：高效液相色谱法（HPLC）气相色谱法（GC）,固定相,色谱过程,流动相,被分离组分,保留时间定性,峰面积（或峰高）定量,色谱的保留行为,高效液相色谱法（HPLC）固定相、流动相及检测器的选择常用系统固定相（色谱柱）：十八烷基键合硅胶C18流动相：甲醇-水、乙腈-水检测器：紫外吸收检测器,分析型色谱柱,各种类型色谱柱,色谱柱,内径：4.6mm长度：15mm、25mm柱填料粒度：510m,检测器紫外检测器（UVD最常用）、荧光检测器、示差折光检测器、电化学检测器、二极管阵列检测器（DVD）、蒸发光散射检测器（ELSD）和质谱检测器（MS）等,高效液相色谱法（HPLC）系统适用性试验用规定的对照品对仪器进行试验和调整,理论板数（n）分离度（R）重复性（RSD）拖尾因子（T）,1）色谱柱的理论板数（n）n值越大柱效越高，应高于规定的最小理论板数,tR保留时间,Wh/2半高峰宽,2）分离度（R）R值越大分离效果越好在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，按下式计算待测峰（定量峰）与相邻峰的分离度。除另有规定外，应大于1.5。,3）重复性考察测量的精密度在规定条件下，取一定量的对照液，连续进样35次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0。RSD计算公式,例题取某对照品溶液10l，连续进样5次，记录各次色谱峰峰面积如下，试判断色谱系统重复性是否符合规定。,X=19898.1S=586.789RSD=2.9%不符合规定,4）拖尾因子（T）考察色谱峰的对称性T值越接近于1.0色谱峰的对称性越好，测量的准确度越高。采用峰高法测量时，应检查待测峰的T是否符合规定。除另有规定外，T应在0.951.05之间。,W0.05h为0.05峰高处的峰宽d1为峰极大至峰前沿之间的距离,选择适宜的物质作为内标物，以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法称为内标法。内标法的关键是选择合适的内标物。校正因子（f）其含义为：内标物峰面积与其浓度之比（As/Cs）是对照品峰面积与其浓度之比（AR/CR）的多少倍。,含量测定内标加校正因子法：,对照+内标,样品+内标,样品,内标,对照,内标,C样=fA样/(A内/C内),校正因子f=(A内/C内)/(A对/C对),外标法：（1）外标一点法被测成分与其峰面积成正比关系要求供试液与对照液浓度相近,样品,对照,外标法：（2）标准曲线法绘制浓度峰面积(峰高)标准曲线；拟合回归方程并计算拟合常数；测定供试品峰面积(峰高)，带入方程，求出浓度。,特点及要求：外标法不使用校正因子，准确性较高，操作条件变化对结果准确性影响较大。对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。,基本原理各组分在固定相与载气之间由于分配系数不同而按不同顺序被带出，分配系数小的组分先流出，分配系数大的后流出,以气体为流动相的色谱法,气相色谱法（GC）,优点灵敏度高、样品用量少分离效能高，分离速度快,缺点受样品蒸气压的限制不适于难气化和热稳定的药物,色谱柱、载气及检测器的选择,气源进样及气化系统色谱柱和柱温箱检测器热导检测器氢火焰离子化检测器电子捕获检测器,ChP（2005）对气相色谱仪的一般要求色谱柱填充柱或毛细管柱（空心柱)固定液高沸点液体载气氮气检测器氢火焰离子化检测器（FID）检测温度高于柱温一般250350,系统适用性试验：同HPLC法含量测定：手动进样时，进样口温度高，注射器插入胶垫后针尖部分受热，以致针尖内溶液受热膨胀，部分溶液会被挤入进样口，使进样量发生偏差。以内标法为主，操作及计算方法同HPLC法,第三节药品质量标准分析方法验证,一、目的证明所用的分析方法适合相应的检验要求,（一）起草新药质量标准时（二）改变生产工艺时改变制剂处方修订原分析方法时,二、用途,三、需验证的分析项目鉴别检查：杂质定量或限度检查含量测定：原料药或制剂中有效成分及制剂中其他成分（如降解产物、防腐剂等）,四、验证指标,准确度精密度专属性检测限定量限线性范围耐用性,重复性中间精密度重现性,（一）准确度该法测定结果与真实值或参考值接近程度用百分回收率%表示,测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。,回收率100,数据要求规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。,原料药用已知浓度的对照品测定，或将本法测定结果与另一已建立准确度的方法的测定结果相比。制剂用已知量的被测物混合物测定，或与另一已建立准确度的方法的测定结果相比。,1.含量测定方法的准确度,2.杂质定量测定的准确度向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较。,（二）精密度,偏差（d）标准偏差（SD）相对标准偏差（RSD）,变异系数（CV）,同一均匀样品，经多次取样测定，所得结果之间的接近程度,*重复性同人、仪器、时间*中间精密度同室，但不同人、仪器、时间*重现性不同地方协同检验,（三）专属性（选择性）,在有其他成分（杂质、降解产物、辅料等）可能存在时，该分析方法对待测组分准确而专属的测定能力,鉴别反应、杂质检查、含量测定方法均应考察,（四）检测限LOD,样品中待测组分能被检测出的最低量是限度试验参数，无需定量测定。常用%、ppm、ppb表示。,仪器分析法,检测限（D）灵敏度（S）噪音（N）,或,把低浓度样品信号与空白样品信号进行比较，按信噪比（S/N）3:1或2:1时的相应浓度或进样量为检测限,非仪器分析法能观察到实验现象的最低浓度为检测限,（五）定量限LOQ,样品中被测组分能被定量测定的最低量（应达到一定的准确度和精密度）常用%、ppm、ppb表示,非仪器分析法用已知浓度的样品确定定量限，将测定结果计算准确度和精密度,仪器分析法按信噪比10:1时的相应浓度或进样量为定量限,N,LOD:S/N=3,LOQ:S/N=10,（六）线性,是指在一定范围内，样品浓度与检测结果的线性关系,（最小二乘法）线性回归ya+bx,相关系数r接近1越好,标准曲线的制备：（1）57个系列浓度标样（2）1个空白样品（3）1个零标准（空白样品内标）空白和零标准仅作为对干扰的考察，不用作标准曲线计算。数据要求：列出回归方程、相关系数和线性图,（七）范围,指在达到一定精密度、准确度和线性的条件下，该方法适用的高低浓度或量的区间,标准曲线的高低浓度范围即为线性范围,（八）耐用性（粗放性）,指测定条件稍有变动时，测定结果不受影响的承受程度,是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度,鉴别仅需专属性、耐用性,2、定量仅不需检测限,验证内容的确定：,定量,限量,耐用性,范围,线性,定量限,检测限,专属性,精密度,准确度,含量测定,杂质测定,鉴别,项目内容,四、生物样品分析前处理技术一般考虑根据生物样品种类血-除蛋白质尿-缀合物水解唾液-除去粘蛋白,根据测定方法免疫分析灵敏、专属前处理要求简单光谱分析灵敏、选择性差前处理要求高色谱分析准确、精密，专属除蛋白质,根据药物理化性质酸碱度，溶解性，挥发性，紫外吸收性质等药物的浓度如ng，ug，mg级测定目的如药代动力学、代谢分型等,去除蛋白质目的：使药物从结合状态下释放出来减少提取过程中的乳化消除干扰，保护色谱柱常用去蛋白方法：加入与水相混溶的有机溶剂使蛋白质分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，与蛋白质结合的药物被释放出来（甲醇、乙醇、乙腈、丙